Rôle inattendu de la protéine des jonctions intercellulaires Zonula Occludens-1 (ZO-1) dans la régulation de l’ARN et de la prolifération des cellules endothéliales
Thesis or Dissertation
2017-12 (degree granted: 2018-06-27)
Author(s)
Advisor(s)
Level
DoctoralDiscipline
Pathologie et biologie cellulairesAbstract(s)
Les jonctions intercellulaires entre les cellules endothéliales jouent un rôle primordial
dans la régulation de l’intégrité vasculaire. ZO-1 est une protéine essentielle pour la formation
et le maintien de ces jonctions. Les voies de signalisation qui régulent la fonction de ZO-1 aux
jonctions intercellulaires suite à une stimulation par des facteurs de croissance demeurent
méconnues. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et l’angiopoietin-1
(Ang-1) sont de puissants agents pro-angiogéniques. L'action concertée de plusieurs voies de
signalisation dans les cellules endothéliales activées par le VEGF et l’Ang-1 module la
réponse angiogénique. Le VEGF et l’Ang-1, via leur récepteur respectif VEGFR-2 et Tie2,
activent plusieurs voies de signalisation afin d’induire la migration, la prolifération et la survie
cellulaire. D’ailleurs, ces deux facteurs de croissance jouent un rôle distinct au niveau des
jonctions des cellules endothéliales. Notre objectif était d’identifier, en utilisant des approches
de protéomiques, de nouveaux mécanismes cellulaires qui participent aux processus
biologiques importants dans les cellules endothéliales afin de mieux comprendre le
développement vasculaire et l’angiogenèse.
Premièrement, nous avons effectué une analyse comparative par spectrométrie de
masse du phosphoprotéome de cellules endothéliales stimulées avec le VEGF ou l’Ang-1.
L’analyse bioinformatique du réseau d’interactions des protéines régulées par le traitement au
VEGF et à l’Ang-1 a révélé un lien entre la prolifération cellulaire déterminée par l’activation
de MAPK et la protéine ZO-1. Nous avons trouvé que la réduction des niveaux cellulaires de
ZO-1 est une étape nécessaire lors de l’induction de la prolifération des cellules endothéliales.
Ceci a été observé tant dans les cellules endothéliales en culture in vitro que lors du
développement vasculaire rétinien postnatal chez la souris.
Deuxièmement, notre analyse phosphoprotéomique nous a permis d’identifier que la
protéine ZO-1 est phosphorylée sur la Ser617 suite à une stimulation par le VEGF et les sites
Ser912 et Ser926 suite à une stimulation par l’Ang-1. Nous avons investigué la fonction de ces
résidus de ZO-1 et nous avons trouvé que la Ser617 de ZO-1 joue un rôle essentiel au niveau
des jonctions cellulaires et dans le contrôle de la prolifération des cellules endothéliales.
Troisièmement, nous avons déterminé par spectrométrie de masse les protéines qui
interagissent avec ZO-1 dans des cellules endothéliales traitées ou non avec le VEGF. Nous
avons trouvé que la protéine de jonctions ZO-1 interagit avec plusieurs protéines impliquées
dans la modulation de l’ARN. Le traitement au VEGF modifie l’interaction de ZO-1 avec
certaines protéines de liaison à l’ARN. Cette étude montre un lien intéressant et nouveau entre
ZO-1 et les protéines impliquées dans la régulation de l’ARN.
En résumé, nos résultats ont permis l’identification des nouvelles voies de signalisation
dans les cellules endothéliales qui mèneront à une meilleure compréhension du développement
vasculaire et de l’angiogenèse. Nous avons révélé ZO-1 en tant que noeud d’une voie de
signalisation qui lie les jonctions intercellulaires et la prolifération des cellules endothéliales.
En plus, nous avons découvert un nouveau lien entre ZO-1 et les protéines de liaison à l’ARN.
Ceci apporte une meilleure compréhension du rôle de ZO-1 dans la biologie des cellules
endothéliales. Intercellular junctions between endothelial cells play a critical role in maintaining
vascular integrity. ZO-1 is an essential protein that regulates important signaling pathways
during angiogenesis. The basic mechanisms activated by growth factors that are involved in
the regulation of ZO-1 function at the cell-cell junction are poorly studied. Vascular
endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin-1 (Ang-1) are essential factors to promote
angiogenesis through the regulation of a plethora of signaling events in endothelial cells.
VEGF and Ang-1, through their receptors VEGFR-2 and Tie-2 respectively, activates many
common intracellular signaling pathways in endothelial cells to promote survival, proliferation
and migration. However, these growth factors play antagonistic roles in the regulation of cellcell
junctions. Although pathways activated by VEGF and Ang-1 are being established, the
unique signaling nodes at endothelial junctions conferring specific responses to each factor
remain poorly defined. Our objective was to identify, using proteomics, novel intracellular
mechanisms that are involved in important biological processes in endothelial cells in order to
better understand the vascular development and angiogenesis.
First, we conducted a large-scale comparative phosphoproteomic analysis of signaling
pathways activated by VEGF and Ang-1 in endothelial cells using mass spectrometry.
Analysis of VEGF and Ang-1 networks of regulated phosphoproteins revealed a link between
the junctional protein ZO-1 and the proliferation of endothelial cells. We found that the
reduction of cellular ZO-1 levels is necessary for endothelial cell proliferation. This was
shown in vitro and during vascular development of the mouse postnatal retina.
Second, our phosphoproteomic study revealed that ZO-1 is phosphorylated on the
Serine 617 when cells were treated with VEGF. Thus, we investigated the role of these
residues of ZO-1 and we found that the Ser617 of ZO-1 is essential for its function on cell-cell
junctions and the proliferation of endothelial cells.
Third, we determined the interactome of ZO-1 in endothelial cells treated or not with
VEGF using affinity purification coupled to mass spectrometry. Interestingly, we found that
the junctional protein ZO-1 interacts with RNA binding proteins. VEGF treatment influences
iv
the interaction of ZO-1 with multiple RNA binding proteins. Our results show an intriguing
link between the junctional protein ZO-1 and the RNA binding proteins involved in the
regulation of the RNA machinery.
In summary, we identified crucial signaling pathways in endothelial cells that
contribute to a better understanding of vascular developement and angiogenesis. We
uncovered ZO-1 as a central modulator of endothelial cell proliferation during angiogenesis.
Moreover, we revealed a link between ZO-1 and RNA binding proteins. This allowed us to
better understand the role of ZO-1 in endothelial cell biology.
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