Rôle inattendu de la protéine des jonctions intercellulaires Zonula Occludens-1 (ZO-1) dans la régulation de l’ARN et de la prolifération des cellules endothéliales

Abstract

Les jonctions intercellulaires entre les cellules endothéliales jouent un rôle primordial dans la régulation de l’intégrité vasculaire. ZO-1 est une protéine essentielle pour la formation et le maintien de ces jonctions. Les voies de signalisation qui régulent la fonction de ZO-1 aux jonctions intercellulaires suite à une stimulation par des facteurs de croissance demeurent méconnues. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et l’angiopoietin-1 (Ang-1) sont de puissants agents pro-angiogéniques. L'action concertée de plusieurs voies de signalisation dans les cellules endothéliales activées par le VEGF et l’Ang-1 module la réponse angiogénique. Le VEGF et l’Ang-1, via leur récepteur respectif VEGFR-2 et Tie2, activent plusieurs voies de signalisation afin d’induire la migration, la prolifération et la survie cellulaire. D’ailleurs, ces deux facteurs de croissance jouent un rôle distinct au niveau des jonctions des cellules endothéliales. Notre objectif était d’identifier, en utilisant des approches de protéomiques, de nouveaux mécanismes cellulaires qui participent aux processus biologiques importants dans les cellules endothéliales afin de mieux comprendre le développement vasculaire et l’angiogenèse. Premièrement, nous avons effectué une analyse comparative par spectrométrie de masse du phosphoprotéome de cellules endothéliales stimulées avec le VEGF ou l’Ang-1. L’analyse bioinformatique du réseau d’interactions des protéines régulées par le traitement au VEGF et à l’Ang-1 a révélé un lien entre la prolifération cellulaire déterminée par l’activation de MAPK et la protéine ZO-1. Nous avons trouvé que la réduction des niveaux cellulaires de ZO-1 est une étape nécessaire lors de l’induction de la prolifération des cellules endothéliales. Ceci a été observé tant dans les cellules endothéliales en culture in vitro que lors du développement vasculaire rétinien postnatal chez la souris. Deuxièmement, notre analyse phosphoprotéomique nous a permis d’identifier que la protéine ZO-1 est phosphorylée sur la Ser617 suite à une stimulation par le VEGF et les sites Ser912 et Ser926 suite à une stimulation par l’Ang-1. Nous avons investigué la fonction de ces résidus de ZO-1 et nous avons trouvé que la Ser617 de ZO-1 joue un rôle essentiel au niveau des jonctions cellulaires et dans le contrôle de la prolifération des cellules endothéliales. Troisièmement, nous avons déterminé par spectrométrie de masse les protéines qui interagissent avec ZO-1 dans des cellules endothéliales traitées ou non avec le VEGF. Nous avons trouvé que la protéine de jonctions ZO-1 interagit avec plusieurs protéines impliquées dans la modulation de l’ARN. Le traitement au VEGF modifie l’interaction de ZO-1 avec certaines protéines de liaison à l’ARN. Cette étude montre un lien intéressant et nouveau entre ZO-1 et les protéines impliquées dans la régulation de l’ARN. En résumé, nos résultats ont permis l’identification des nouvelles voies de signalisation dans les cellules endothéliales qui mèneront à une meilleure compréhension du développement vasculaire et de l’angiogenèse. Nous avons révélé ZO-1 en tant que noeud d’une voie de signalisation qui lie les jonctions intercellulaires et la prolifération des cellules endothéliales. En plus, nous avons découvert un nouveau lien entre ZO-1 et les protéines de liaison à l’ARN. Ceci apporte une meilleure compréhension du rôle de ZO-1 dans la biologie des cellules endothéliales.

Intercellular junctions between endothelial cells play a critical role in maintaining vascular integrity. ZO-1 is an essential protein that regulates important signaling pathways during angiogenesis. The basic mechanisms activated by growth factors that are involved in the regulation of ZO-1 function at the cell-cell junction are poorly studied. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin-1 (Ang-1) are essential factors to promote angiogenesis through the regulation of a plethora of signaling events in endothelial cells. VEGF and Ang-1, through their receptors VEGFR-2 and Tie-2 respectively, activates many common intracellular signaling pathways in endothelial cells to promote survival, proliferation and migration. However, these growth factors play antagonistic roles in the regulation of cellcell junctions. Although pathways activated by VEGF and Ang-1 are being established, the unique signaling nodes at endothelial junctions conferring specific responses to each factor remain poorly defined. Our objective was to identify, using proteomics, novel intracellular mechanisms that are involved in important biological processes in endothelial cells in order to better understand the vascular development and angiogenesis. First, we conducted a large-scale comparative phosphoproteomic analysis of signaling pathways activated by VEGF and Ang-1 in endothelial cells using mass spectrometry. Analysis of VEGF and Ang-1 networks of regulated phosphoproteins revealed a link between the junctional protein ZO-1 and the proliferation of endothelial cells. We found that the reduction of cellular ZO-1 levels is necessary for endothelial cell proliferation. This was shown in vitro and during vascular development of the mouse postnatal retina. Second, our phosphoproteomic study revealed that ZO-1 is phosphorylated on the Serine 617 when cells were treated with VEGF. Thus, we investigated the role of these residues of ZO-1 and we found that the Ser617 of ZO-1 is essential for its function on cell-cell junctions and the proliferation of endothelial cells. Third, we determined the interactome of ZO-1 in endothelial cells treated or not with VEGF using affinity purification coupled to mass spectrometry. Interestingly, we found that the junctional protein ZO-1 interacts with RNA binding proteins. VEGF treatment influences iv the interaction of ZO-1 with multiple RNA binding proteins. Our results show an intriguing link between the junctional protein ZO-1 and the RNA binding proteins involved in the regulation of the RNA machinery. In summary, we identified crucial signaling pathways in endothelial cells that contribute to a better understanding of vascular developement and angiogenesis. We uncovered ZO-1 as a central modulator of endothelial cell proliferation during angiogenesis. Moreover, we revealed a link between ZO-1 and RNA binding proteins. This allowed us to better understand the role of ZO-1 in endothelial cell biology.