Combinaison d’approches classiques et de génétique inverse en vue d'une meilleure compréhension du tropisme et de l'activité oncolytique du réovirus de mammifères

Abstract

Le réovirus de mammifères se multiplie et détruit préférentiellement les cellules cancéreuses. Il est d’ailleurs actuellement à l’étude pour traiter divers types de cancers chez l’humain. L’objectif de cette étude était de mieux comprendre les diverses composantes impliquées dans le cycle viral de réovirus qui pourraient potentiellement être importantes dans le contexte d’optimisation de son potentiel oncolytique, ceci en utilisant une combinaison d’approches classiques ainsi que de génétique inverse.L’approche par persistance virale est classiquement utilisée pour identifier de nouveaux mutants de réovirus. Celle-ci a surtout mené à la sélection de mutants de décapsidation chez les cellules L929. Ici, des virus adaptés furent récupérés de cellules Vero (VeroAV) et contrairement aux autres mutants de persistance, ce virus possède des substitutions d’acides aminés sur les protéines mu1 et sigma1. L’approche par génétique inverse a permis de démontrer que la fixation de VeroAV sur les acides sialiques des cellules Vero était favorisée. Les substitutions sur sigma1 seraient principalement responsables de ce phénotype quoique le contexte de la substitution de mu1 puisse affecter l’infectivité du virus. Dans un deuxième volet, il a été remarqué que le virus de type sauvage utilisé pour la génétique inverse (T3DK) était plus sensible à l’interféron comparativement au virus de type sauvage de notre laboratoire (T3DS). Après séquençage complet du virus T3DS nous avons reconstruit, par génétique inverse, le virus T3DS. Nous avons donc pu poursuivre nos études sur le virus P4L-12 précédemment isolé au laboratoire par mutagenèse chimique. Il a été préalablement démontré que P4L-12 possède une meilleure réplication chez les cellules transformées et un blocage plus complet chez les cellules parentales, phénotype relié à une sensibilité accrue à l’interféron. Dans cette étude, des substitutions d’acides aminés sur les protéines sigma3, mu1, muNS et lambda2 furent identifiés. Nous avons démontré, par génétique inverse, que la substitution sur la protéine lambda2 était principalement responsable du phénotype de sensibilité à l’interféron. Ces approches de persistance ou de sélection de mutants sensibles à l’interféron, suivies d’une caractérisation par génétique inverse seront certainement utiles à une meilleure compréhension de réovirus et pourraient contribuer à améliorer son potentiel oncolytique.

The mammalian reovirus preferentially replicates and kills cancer cells. It is therefore currently used in clinical trials to treat various types of cancers in humans. The main objective of this study was to get a better understanding of the various components involved in the reovirus replication cycle that could potentially be important for the optimization of its oncolytic properties using a combination of traditional approaches and the newly described reverse genetics technique. Classically, the viral persistence approach is undertaken to identify new reovirus variants. This has led to the selection of uncoating mutants in L929 cells. In this study, adapted viruses were recovered from Vero cells (VeroAV) and unlike other persistence mutants, VeroAV had amino acid substitutions on the mu1 and the sigma1 proteins. The reverse genetics approach demonstrated that VeroAV had a better binding ability onto sialic acids of Vero cells. Substitutions on sigma1 were found to be mainly responsible for this phenotype although mu1 substitutions may affect virus infectivity. In a second study, we noticed that the reverse genetics wild-type virus (T3DK) was more sensitive to interferon when compared with the wild-type virus from our laboratory (T3DS). After complete sequencing of the T3DS, we then constructed a T3DS by reverse genetics. This allowed us to proceed in our studies of a mutant virus previously recovered in our laboratory by chemical mutagenesis (P4L-12). It was previously established that P4L-12 had an enhanced replication in transformed cells while sparing the parental cells and this phenotype was correlated to an increased sensitivity to interferon. In this study, amino acid substitutions on the sigma3, mu1, muNS and lambda2 proteins were identified. By using the reverse genetics approach, we demonstrated that the substitution found on the lambda2 protein was primarily responsible for the increase in sensitivity to interferon of P4L-12. The combination of approaches based on persistence or selection of mutants sensitive to interferon followed by characterization with reverse genetics will certainly be useful to get a better understanding of reovirus in order to improve its oncolytic capacity.