Combinaison d’approches classiques et de génétique inverse en vue d'une meilleure compréhension du tropisme et de l'activité oncolytique du réovirus de mammifères
Thesis or Dissertation
2014-12 (degree granted: 2015-10-15)
Author(s)
Advisor(s)
Level
DoctoralDiscipline
Virologie et immunologieAbstract(s)
Le réovirus de mammifères se multiplie et détruit préférentiellement les cellules
cancéreuses. Il est d’ailleurs actuellement à l’étude pour traiter divers types de cancers
chez l’humain. L’objectif de cette étude était de mieux comprendre les diverses
composantes impliquées dans le cycle viral de réovirus qui pourraient potentiellement être
importantes dans le contexte d’optimisation de son potentiel oncolytique, ceci en utilisant
une combinaison d’approches classiques ainsi que de génétique inverse.L’approche par persistance virale est classiquement utilisée pour identifier de
nouveaux mutants de réovirus. Celle-ci a surtout mené à la sélection de mutants de
décapsidation chez les cellules L929. Ici, des virus adaptés furent récupérés de cellules
Vero (VeroAV) et contrairement aux autres mutants de persistance, ce virus possède des
substitutions d’acides aminés sur les protéines mu1 et sigma1. L’approche par génétique
inverse a permis de démontrer que la fixation de VeroAV sur les acides sialiques des
cellules Vero était favorisée. Les substitutions sur sigma1 seraient principalement
responsables de ce phénotype quoique le contexte de la substitution de mu1 puisse
affecter l’infectivité du virus.
Dans un deuxième volet, il a été remarqué que le virus de type sauvage utilisé pour
la génétique inverse (T3DK) était plus sensible à l’interféron comparativement au virus de
type sauvage de notre laboratoire (T3DS). Après séquençage complet du virus T3DS nous
avons reconstruit, par génétique inverse, le virus T3DS. Nous avons donc pu poursuivre
nos études sur le virus P4L-12 précédemment isolé au laboratoire par mutagenèse
chimique. Il a été préalablement démontré que P4L-12 possède une meilleure réplication
chez les cellules transformées et un blocage plus complet chez les cellules parentales,
phénotype relié à une sensibilité accrue à l’interféron. Dans cette étude, des substitutions
d’acides aminés sur les protéines sigma3, mu1, muNS et lambda2 furent identifiés. Nous
avons démontré, par génétique inverse, que la substitution sur la protéine lambda2 était
principalement responsable du phénotype de sensibilité à l’interféron. Ces approches de persistance ou de sélection de mutants sensibles à l’interféron,
suivies d’une caractérisation par génétique inverse seront certainement utiles à une
meilleure compréhension de réovirus et pourraient contribuer à améliorer son potentiel
oncolytique. The mammalian reovirus preferentially replicates and kills cancer cells. It is
therefore currently used in clinical trials to treat various types of cancers in humans. The
main objective of this study was to get a better understanding of the various components
involved in the reovirus replication cycle that could potentially be important for the
optimization of its oncolytic properties using a combination of traditional approaches and
the newly described reverse genetics technique. Classically, the viral persistence approach is undertaken to identify new reovirus
variants. This has led to the selection of uncoating mutants in L929 cells. In this study,
adapted viruses were recovered from Vero cells (VeroAV) and unlike other persistence
mutants, VeroAV had amino acid substitutions on the mu1 and the sigma1 proteins. The
reverse genetics approach demonstrated that VeroAV had a better binding ability onto
sialic acids of Vero cells. Substitutions on sigma1 were found to be mainly responsible for
this phenotype although mu1 substitutions may affect virus infectivity.
In a second study, we noticed that the reverse genetics wild-type virus (T3DK) was
more sensitive to interferon when compared with the wild-type virus from our laboratory
(T3DS). After complete sequencing of the T3DS, we then constructed a T3DS by reverse
genetics. This allowed us to proceed in our studies of a mutant virus previously recovered
in our laboratory by chemical mutagenesis (P4L-12). It was previously established that
P4L-12 had an enhanced replication in transformed cells while sparing the parental cells
and this phenotype was correlated to an increased sensitivity to interferon. In this study,
amino acid substitutions on the sigma3, mu1, muNS and lambda2 proteins were
identified. By using the reverse genetics approach, we demonstrated that the substitution
found on the lambda2 protein was primarily responsible for the increase in sensitivity to
interferon of P4L-12.
The combination of approaches based on persistence or selection of mutants
sensitive to interferon followed by characterization with reverse genetics will certainly be
useful to get a better understanding of reovirus in order to improve its oncolytic capacity.
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