Importance de la phosphorylation de la ligase Itch dans la reconnaissance et l'ubiquitylation des protéines à domaine SH3

Abstract

Itch est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans la reconnaissance et la dégradation des protéines par le protéasome. Itch contient trois sites phosphorylés par JNK et il a été démontré que la phosphorylation de ces résidus est nécessaire pour que Itch puisse reconnaître et ubiquityler les protéines c-Jun et JunB. Ces sites de phosphorylation se retrouvent dans le domaine PRD responsable des interactions de Itch avec les protéines à domaine SH3. Si la phosphorylation de Itch par JNK est importante pour réguler son activité avec c-Jun et JunB, on connaît peu de choses sur les interactions de Itch avec les protéines à domaine SH3 ainsi que l’implication de la phosphorylation dans leur régulation. Nous avons donc créé des mutants de Itch par mutagenèse dirigée où les sites de phosphorylation étaient remplacés par des alanines (mutant non phosphorylable) et où l’un des trois sites était remplacé par un acide aspartique (mutant constitutivement phosphorylé). Ces mutants sont utilisés dans des tests d’interaction et d’ubiquitylation, dans le but de déterminer l’impact de la phosphorylation de Itch dans la reconnaissance et l’ubiquitylation des protéines SH3. Nos résultats montrent que, contrairement au modèle proposé, la phosphorylation de Itch n’est pas essentielle à l’interaction de Itch avec l’endophiline, mais la phosphorylation de Itch module l’ubiquitylation ainsi que la dégradation de l’endophiline. La régulation de l’interaction de Itch avec ses substrats est donc différente selon le substrat.

Itch is an ubiquitin ligase involved in protein recognition and degradation by the proteasome. Itch has three phosphorylation sites targeted by JNK. These sites overlap a small proline rich domain responsible for Itch binding to SH3 domain proteins. Phosphorylation of Itch is important for Itch interaction with c-Jun and JunB. However, little is known about Itch interaction with SH3 proteins and the impact of phosphorylation on Itch ability to recognize and ubiquitinate SH3 proteins. We created a phosphomimic mutant of Itch and a mutant of Itch that cannot be phosphorylated by JNK. We tested these mutants in interaction and ubiquitination assays to determine their effect on Itch ability to bind and ubiquitinate Endophilin, an SH3 domain protein. Phosphorylation is not a prerequisite for Itch binding to Endophilin but phosphorylation of Itch modulates Itch ability to ubiquitinate Endophilin. Phosphorylation of Itch also modulates Endophilin fate, as phosphomimic Itch induces degradation of Endophilin compared to non-phosphorylated Itch. These results show that phosphorylation regulates Itch activity towards differents substrates in different ways.