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dc.contributor.advisorMichnick, Stephen
dc.contributor.authorEar, Po Hien
dc.date.accessioned2012-02-29T16:17:28Z
dc.date.availableNO_RESTRICTIONen
dc.date.available2012-02-29T16:17:28Z
dc.date.issued2012-02-02
dc.date.submitted2011-11
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/1866/6314
dc.subjectSaccharomyces cerevisiaeen
dc.subjectsélection positive et négativeen
dc.subjectessai de complémentation des fragments protéiquesen
dc.subjectcytosine désaminase de levureen
dc.subject5-fluorocytosineen
dc.subjectcycle cellulaireen
dc.subjectfacteurs de transcriptionen
dc.subjectSwi6en
dc.subjectactivités transcriptionnellesen
dc.subjectmécanisme de régulationen
dc.subjectphase G1/S du cycle cellulaireen
dc.subjectkinase dépendante des cyclines (CDK)en
dc.subjectcyclineen
dc.subjectcomplexes entre substrats et protéinesen
dc.subjectinteractions protéine-protéinesen
dc.subjectpositive and negative selectionen
dc.subjectProtein-fragment Complementation Assayen
dc.subjectyeast cytosine deaminaseen
dc.subject5-fluorocytosineen
dc.subjectcell cycleen
dc.subjecttranscription factorsen
dc.subjectrewiring transcriptional activitiesen
dc.subjectmechanism of regulation, G1/S phaseen
dc.subjectcyclin dependent kinase Cdk1en
dc.subjectcyclinen
dc.subjectprotein-protein interactionsen
dc.subjectsubstrates and protein complexesen
dc.subject.otherBiology - Molecular / Biologie - Biologie moléculaire (UMI : 0307)en
dc.titleDissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”en
dc.typeThèse ou mémoire / Thesis or Dissertation
etd.degree.disciplineBiochimieen
etd.degree.grantorUniversité de Montréalfr
etd.degree.levelDoctorat / Doctoralen
etd.degree.namePh. D.en
dcterms.abstractLes protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.en
dcterms.abstractProteins are the end-products of gene interpretative machinery. Proteins serve essential roles in defining the structure, integrity and dynamics of the cell and mediate most chemical transformations needed for everything from metabolic catalysis to signal transduction. We know that the central dogma of molecular biology, one gene = one mRNA = one protein is a gross simplification and that a protein may do different things depending on the form in which its mRNA was spliced, how and where it is post-translationally modified, what conformational state it may be in or finally, which other proteins it may interact with. Formation of protein complexes may, themselves, be governed by the states in which proteins are expressed in specific cells, cellular compartments or under specific conditions or dynamic phases such has growth or division. Protein complexes involved in mitotic cell cycle regulation are particularly challenging to dissect since they could only form during specific phases of the cell cycle, are highly regulated by post-translational modifications and can be found in any subcellular compartments. To date, no general methods have been developed to allow fine dissection of these protein complexes. The goal of this thesis was to establish and demonstrate a novel strategy for dissecting protein complexes regulating the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) mitotic cell cycle. In this thesis, I describe my development and optimization of a simple survival-selection Protein-fragment Complementation Assay using the prodrug-converting enzyme, yeast cytosine deaminase as reporter (OyCD PCA). I further describe, in a series of proof of principle studies, applications of the OyCD PCA to dissect the mechanism of transcriptional activation by key mitotic transcription factors and to dissect protein-protein interactions (PPIs) among regulators of the mitotic cell cycle. A key feature of the OyCD PCA is that it can be used to detect both formation and disruption of PPIs by virtue of having positive readouts for both assays. I applied the OyCD PCA in a strategy to dissect interactions between the key transcription factors of the G1/S phase: SBF and MBF. These two heterodimeric transcription factors are composed of, respectively, two distinct DNA-binding subunits named Swi4 and Mbp1 and a common transcription activation subunit called Swi6. I took advantage of the dual selection by OyCD PCA to engineer a specific mutant of Swi6 in order to demonstrate the rewiring of a transcriptional network. We isolated Swi6 with mutations found in its C-terminal domain previously identified for binding Swi4 and Mbp1 and important for SBF and MBF activities. Our results support a model where Swi6 undergoes a conformational change upon binding to Swi4 or Mbp1. In addition, this Swi6 mutant was used to dissect the regulatory mechanism that governs the entry of S. cerevisiae to a new round of cell division also known as START. We found that the SBF and MBF repressor Whi5 directly binds to the C-terminal domain of Swi6. Finally, I applied the OyCD PCA to dissect the yeast cyclin dependent kinase Cdk1-protein complexes. Cdk1 is the essential kinase that regulates cell cycle progression and can phosphorylate a large number of different substrates by teaming up with one of nine cyclin regulatory proteins (Cln1-3, Clb1-6). I describe a strategy to identify interaction partners of Cdk1 that can easily be scaled up for a genome-wide screen and associate the complexes with the appropriate cyclin(s) required for mediating the interaction using the OyCD PCA and deletion of the cyclin genes. My results allow us to postulate which phase(s) of the mitotic cell cycle Cdk1 may phosphorylate proteins and what function potential or known substrates of Cdk1 may take on during that phase(s). For example, we identified the interaction between Cdk1 and the γ-tubulin (Tub4) to be dependent upon Clb3, consistent with its role in mediating nucleation and growth of mitotic microtubule bundles on the spindle pole body. This strategy can also be applied to study other PPIs that are contingent upon accessory subunits.en
dcterms.languageengen


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