Caractérisation de la MAP kinase atypique Erk4 : activation et fonction physiologique

Abstract

Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris.

En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5.

Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo.

MAP kinases are essential enzymes implicated in 7 distinct signaling pathways that allow cells to respond appropriately to extracellular stimuli. In mammals, Erk1/2, Jnk, p38 and Erk5 are the best characterized MAP kinases. These enzymes play important roles in embryogenesis, cell proliferation and differentiation and in response to cellular stresses. Erk4 is an atypical member of the MAP kinase family. First, its activation loop is composed of an SEG motif instead of the well conserved TXY motif found in MAP kinases. Second, Erk4 has a C-terminal extension following the kinase domain that is not present in classical MAP kinases. Despite its identification more than a decade ago, the function of Erk4 remains elusive. Moreover, the signaling pathway as well as the regulatory mechanism leading to Erk4 activation in still uncharacterized. The only identified substrate of Erk4 is the MAPKAP kinase MK5, but the functional relevance of this interaction is still unknown. To gain information about the atypical MAP kinase Erk4, we decided to study the activation mechanism of Erk4 and its physiological function using a gene targeted deletion approach in mice.

Regarding the activation of Erk4, we showed that the activation loop of Erk4 (S186EG) is constitutively phosphosphorylated in vivo and that this phosphorylation is not modulated by classical MAP kinase stimuli such as serum and sorbitol. However, we observed that phosphorylation of S186 increases in the presence of MK5 and we showed that this increase is independent of the kinase activity of either kinases. Moreover, we established that phosphorylation of Erk4 activation loop is required for the stable interaction between Erk4 and MK5 as well as for the activation and cytoplasmic relocalisation of MK5. Thus, our study reveals that Erk4 is differently regulated than classical MAP kinases and that Erk4 activation loop phosphorylation is important for its role in the regulation of MK5 activity. In parallel, our results revealed the existence of an “Erk4 kinase” whose recruitment and/or activation seems to be facilitated by MK5.

To gain information about the physiological function of Erk4 we generated Erk4 deficient mice. Gene-targeted inactivation of Erk4 is viable and these mice present no gross abnormality. To explain the absence of phenotype, we analyzed the expression of Erk3, the paralog of Erk4, to determine if it could compensate for the loss of Erk4. Our analysis revealed that Erk3 expression in Erk4-/- mice is not up-regulated during embryogenesis nor in adult mice tissues in order to compensate for the loss of Erk4. We next addressed the question of redundancy between Erk4 and Erk3. In our laboratory, Erk3-/- deficient mice were also generated and the phenotype of these mice was recently analyzed. This study revealed that gene inactivation of Erk3 leads to intra-uterine growth retardation, lung maturation defect and neo-natal lethality. We then investigated the contribution of Erk4 in these phenotypes. The analysis of Erk4-/- mice revealed that inactivation of Erk4 did not delay intra-uterine growth nor cause pulmonary maturation defect. Moreover, we showed that additional loss of Erk4 in Erk3-/-mice does not accentuate Erk3-deficient mice phenotype. Thus, this study reveals that, contrary to Erk3, Erk4 is dispensable for mice development under normal condition and that Erk4 and Erk3 have non-redundant functions in vivo.