Extraction, purification et caractérisation d’isoformes d’hexokinase du tubercule de pomme de terre (Solanum tuberosum)

Abstract

L’hexokinase (HK) est la première enzyme du métabolisme des hexoses et catalyse la réaction qui permet aux hexoses d’entrer dans le pool des hexoses phosphates et donc par le fait même la glycolyse. Bien que le glucose soit son principal substrat, cette enzyme peut aussi phosphoryler le mannose et le fructose. Malgré son importance dans le métabolisme primaire, l’HK n’a jamais été purifiée à homogénéité sous forme native. Le but de ce travail était donc de purifier une isoforme d’HK à partir de tubercule de Solanum tuberosum et par la suite de caractériser ses propriétés cinétiques. Bien avant que je commence mon travail, un groupe de recherche avait déjà séparé et partiellement purifié trois isoformes d’HK de S. tuberosum. Un protocole d’extraction était donc disponible, mais l’HK ainsi extraite était peu stable d’où le besoin d’y apporter certaines modifications. En y ajoutant certains inhibiteurs de protéases ainsi qu’en modifiant les concentrations de certains éléments, le tampon d’extraction ainsi modifié a permis d’obtenir un extrait dont l’activité HK était stable pendant au moins 72h après l’extraction, en empêchant la dégradation. À l’aide du tampon d’extraction optimisé et d’une chromatographie sur colonne de butyl sépharose, il a été possible de séparer 4 isoformes d’HKs. Par la suite, une isoforme d’HK (HK1) a été purifiée à l’homogénéité à l’aide de 5 étapes de chromatographie supplémentaires. En plus de caractériser les propriétés cinétiques de cette enzyme, l’analyse de séquençage par MS/MS a permis de l’associer au produit du gène StHK1 de Solanum tuberosum. Avec une activité spécifique de 10.2 U/mg de protéine, il s’agit de l’HK purifiée avec l’activité spécifique la plus élevée jamais rapportée d’un tissu végétal.L’ensemble des informations recueillies lors de la purification de HK1 a ensuite été utilisée pour commencer la purification d’une deuxième isoforme (HK3). Ce travail a permis de donner des lignes directrices pour la purification de cette isoforme et certains résultats préliminaires sur sa caractérisation enzymatique.

Hexokinase (HK) catalyzes the first step of hexose metabolism by phosphorylating hexose to generate the corresponding hexose phosphate thereby allowing hexose entrance in glycolysis. Even though glucose is the main substrate, HK can also phosphorylate a broad spectrum of hexoses. Despite its importance this enzyme has never been purified to homogeneity in a native form. The aim of this work was therefore to purify this enzyme from Solanum tuberosum tubers and subsequently characterize its kinetic properties. Before I started this work, another group had already separated and partially purified 3 HK isoform from S. tuberosum. An extraction protocol was available but improvement was necessary since the extracted HK had little stability. By adding some protease inhibitors and by modifying the concentration of certain components in the extraction buffer we were able to obtain an extract with a HK activity stable for at least 72 h after extraction by preventing degradation. With this buffer and chromatography on butyl sepharose it was possible to separate 4 HK isoforms from S. tuberosum. After 5 more chromatographic steps, one HK isoform was purified to homogeneity (HK1). This enzyme was characterized and sequenced by MS/MS. We were able to associate this protein sequence with the gene product of StHK1 from S. tuberosum. With a specific activity of 10.2 U/mg of protein, this is the HK with the highest specific activity ever reported from a plant tissue. All the information gathered while purifying HK1 was used to undertake the purification of a second isoform (HK3). We were able to obtain preliminary results on its kinetic properties.