Mécanismes moléculaires de permissivité à l'infection et de persistance du VIH dans les lymphocytes T CD4

Abstract

L'épidémie mondiale du VIH reste un défi majeur de santé, avec plus de 38 millions de personnes touchées à ce jour. Bien que la thérapie antirétrovirale (TAR) ait considérablement amélioré la vie des personnes vivant avec le VIH (PVVIH), elle ne permet pas l'éradication du virus et nécessite d’être prise à vie. En effet, le virus s’intègre aux génomes de ses cellules cibles, principalement des lymphocytes T CD4 mémoires, formant ainsi des réservoirs viraux qui sont maintenus au cours du temps. L’arrêt de la TAR conduit à la production de nouvelles particules virales provenant de ces réservoirs cellulaires. Bien que la charge virale soit sous contrôle grâce à la TAR, elle ne bloque pas les étapes de transcription et de traduction du virus ce qui permet la production de produits viraux contribuant à maintenir un environnement pro-inflammatoire. De plus, la TAR ne permet pas de restaurer les fonctions et la fréquence de cellules T CD4 des muqueuses et notamment des lymphocytes Th17 intestinaux. A la suite de l’infection, les PVVIH présentent une inflammation chronique persistante qui n’est pas rétablie par la TAR. Cette inflammation contribue au vieillissement accéléré et au développement de comorbidités non liées au Syndrome de l’ImmunoDéficience Acquise (SIDA) chez les PVVIH. La persistance du virus dans les réservoirs anatomiques et cellulaires ainsi que l’inflammation chronique chez les PVVIH nécessitent de nouvelles stratégies. Mon projet doctoral se divise en trois axes et vise à étudier les mécanismes de persistance et de réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4 afin d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans la première partie de la thèse j’ai étudié le rôle du métabolisme cellulaire dans la régulation de la réplication du VIH. Le VIH infecte préférentiellement les cellules T CD4 avec une activité métabolique élevée. La voie de signalisation mTOR (mechanistic Target of Rapamycin) régule le métabolisme du glucose et facilite la réplication du VIH. Une étude clinique, menée par notre laboratoire, a examiné les effets de la metformine sur l’inflammation chronique et la taille des réservoirs viraux chez des PVVIH sous TAR. L’étude a montré une réduction de l’infiltration des lymphocytes T CD4 dans les muqueuses intestinales ainsi qu’une réduction de la transcription résiduelle du VIH chez 68% des participants. La première partie de mon projet de doctorat portait sur l’exploration des effets de la metformine in vitro sur la réplication et la persistance du VIH dans des lymphocytes T CD4. Les résultats ont montré que la metformine bloque la libération des virions à la suite d’une infection par le VIH in vitro et favorise la reconnaissance des cellules du réservoir viral provenant de PVVIH réactivées par leur TCR par des anticorps neutralisants. Dans la deuxième partie de la thèse je me suis intéressée au rôle de la machinerie de l’horloge circadienne dans la régulation de la transcription du VIH. La grande majorité des processus physiologiques chez les mammifères présentent un rythme dépendant de la rotation de 24h de la Terre que l’on appelle rythme circadien. Les cellules de l’immunité présentent également un rythme circadien dans leurs fonctions et leur nombre. La réplication du VIH in vitro est également cyclique et sa transcription est sous contrôle des facteurs de transcription CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput), BMAL1 (Basic helix-loop-helix ARNT-like protein 1) et REV-ERB, gènes de la machinerie de l’horloge. La deuxième partie de ma thèse porte sur l’exploration de la variation journalière des lymphocytes T CD4 et de la transcription résiduelle du VIH chez les PVVIH sous TAR. Nos résultats révèlent que les rythmes circadiens de la mélatonine et du cortisol sont maintenus chez les PVVIH. Nous avons démontré une variation du compte cellulaire de différents sous-types de cellules T CD4 dans le sang avec un compte au plus bas à midi et un compte le plus haut en soirée à 20h. La transcription résiduelle du VIH dans les lymphocytes T CD4 est impactée par l’heure de la journée avec un pic à 4h du matin et une recirculation des réservoirs viraux compétant à la transcription à 20h. Un séquençage ARN nous a permis de démontrer de fortes modifications du transcriptome des lymphocytes T CD4 à 20h et à 4h avec une augmentation de l’expression du gène JUN impliqué dans la transcription du VIH à 4h. Finalement, dans la troisième partie de ma thèse j’ai exploré le rôle du facteur de transcription RORC2 (RAR-related orphan receptor C2) dans la régulation de la réplication du VIH-1 dans un modèle préclinique de souris humanisées. Les lymphocytes Th17 sont des cellules nécessaires au maintien des fonctions des muqueuses. L’infection par le VIH conduit rapidement à une forte déplétion de ces cellules. Certains de ces cellules survivent à l’infection par le VIH et contribuent fortement à la persistance du VIH dans les réservoirs. Notre laboratoire a démontré que RORC2, facteur de transcription majoritaire des lymphocytes Th17, contrôle l’expression des gènes du VIH. La troisième partie de la thèse se concentre sur l'inhibition de RORC2, avec la drogue GSK805, dans un modèle de souris humanisées dans le but de limiter la réplication du VIH in vivo. Les résultats indiquent que l'inhibition de RORC2 réduit les fonctions (i.e. IL-17A) ainsi que la fréquence des lymphocytes Th17, identifiés grâce à l’expression de CCR6, CD26, CD161 et RORC2 dans des souris non-infectées. L’utilisation de GSK805 après le pic de réplication du VIH (environ 6 semaines après l’infection par le VIH) pour inhiber RORC2 n’induit pas une réduction de la charge virale plasmatique ni de la fréquence de cellules infectées dans différents organes (rate, foie, poumons) probablement dû à a déplétion massive précoce des lymphocytes Th17. Cette étude souligne l'importance d'intervenir précocement dans l'infection par le VIH. En conclusion, ce travail de doctorat met en évidence l’impact du métabolisme des lymphocytes T CD4 dans la réactivation du VIH, la rythmicité dans la transcription du VIH dans les réservoirs sous TAR ainsi que l’importance des lymphocytes Th17 dans la réplication du VIH in vivo. Ces projets démontrent l’importance d’envisager des approches multiples et diversifiées pour l’établissement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la guérison et/ou éradication du VIH.

The HIV epidemic remains a major health problem, with over 38 million people affected. Although antiretroviral therapy (ART) has considerably improved the quality of life of people with HIV (PWH), it does not eradicate the virus and needs to be taken every day. HIV integrates into the genome of its target cells, mainly memory CD4+ T cells, forming viral reservoirs that persist over time. ART interruption leads to the production of new viral particles. Although ART maintains the viral load under control, it does not block the transcription and translation steps of the virus, leading to the production of viral by-products which contribute to maintaining a pro-inflammatory environment. Furthermore, ART does not restore the function and frequency of mucosal CD4+ T-cells, particularly intestinal Th17 cells. Following infection, PWH display persistent chronic inflammation that is not restored by ART. This inflammation contributes to accelerated aging and the development of non-AIDS-related co-morbidities. The persistence of the virus in anatomical and cellular reservoirs, as well as chronic inflammation in PWH, point to the need of new therapeutic strategies. My Ph.D. project is divided into three axes and aims to study the mechanisms of HIV persistence and replication in CD4+ T-cells to explore new therapeutic approaches. In the first part of my thesis, I studied the role of cellular metabolism in the regulation of HIV replication. HIV preferentially infects CD4+ T-cells with high metabolic activity. The mTOR (mechanistic Target of Rapamycin) signaling pathway regulates glucose metabolism and facilitates HIV replication. A clinical study conducted by our laboratory examined the effects of metformin on chronic inflammation and viral reservoir size in PWH on ART. The results showed a reduction in CD4+ T-cell infiltration in the intestinal mucosa and a reduction in residual HIV transcription in 68% of participants. The first part of my PhD project explored the effects of metformin in vitro on HIV replication and persistence in CD4 T-cells. Results showed that metformin blocks virion release upon HIV infection in vitro and promotes the recognition of viral reservoir by neutralizing antibodies. In the second part of the thesis, I focused on the role of the circadian clock machinery in the regulation of HIV transcription. Most physiological processes in mammals have a rhythm dependent on the 24h rotation of the Earth, known as the circadian rhythm. Immune cells also exhibit a circadian rhythm in their functions and counts. HIV replication in vitro is also cyclic, and its transcription is under the control of CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput), BMAL1 (Basic helix-loop-helix ARNT-like protein 1) and REV-ERB, transcription factors of the circadian machinery. The second part of my Ph.D. explores the daily variation of CD4 T-cells and residual HIV transcription in ART-treated PWH. Our results reveal that circadian rhythms of melatonin and cortisol are maintained in PWH. We demonstrated variation in the cell counts of different CD4+ T-cell subsets in the blood, with the lowest count at noon and the highest in the evening at 20:00. Residual HIV transcription in CD4+ T-cells is impacted by time of day, with a peak at 4:00 and recirculation of transcriptionally competent reservoirs at 20:00. RNA sequencing enabled us to demonstrate strong modifications of the CD4+ T-cells transcriptome at 20:00 and 4:00, with increased expression of the JUN gene involved in HIV transcription at 4:00. Finally, in the third part of my thesis, I explored the role of the transcription factor RORC2 (RAR-related orphan receptor C2) in the regulation of HIV-1 replication in a preclinical humanized mouse model. Th17 cells are needed for maintaining mucosal functions. HIV infection rapidly leads to a severe depletion of these cells. Some of these cells survive HIV infection and strongly contribute to the persistence of HIV. Our laboratory has demonstrated that RORC2, the major transcription factor of Th17 cells, controls HIV gene expression. The third part of my project focuses on the inhibition of RORC2, with the drug GSK805, in a humanized mouse model with the aim of limiting HIV replication in vivo. Results indicate that inhibition of RORC2 reduces the functions (i.e., IL-17A) and frequency of Th17 cells, identified based on the expression of CCR6, CD26, CD161 and RORC2 in uninfected mice. The use of GSK805 after the peak of HIV replication (around 6 weeks post-HIV infection) to inhibit RORC2 did not induce a reduction in plasma viral load nor in the frequency of infected cells in various organs (spleen, liver, lungs), probably due to early massive depletion of Th17 cells. This study underlines the importance of early intervention in HIV infection. In conclusion, my project highlights the impact of CD4 T-cell metabolism on HIV reactivation, the rhythmicity of residual HIV transcription in viral reservoirs during ART, and the key place of Th17 cells in HIV replication in vivo. This project demonstrates the importance of considering multiple and diversified approaches to develop new therapeutic strategies for the cure and/or eradication of HIV.