Cloning and characterization of a new cAMP responsive element binding protein on rat angiotensinogen gene

Abstract

Angiotensinogen (ANG) is a single peptide glycoprotein that contains 452 amino acids in human (453 amino acids in rodents). ANG releases a 10-amino acids peptide known as angiotensin l (Ang I) from it's N-terminal when acted by renin, a acidic protease. Ang I can be fiirther converted into angiotensin II (Ang II) by angiotensin converting enzyme (ACE). Ang II is one of the most potent vasoconstrictors known. Ang II also acts on the brain to mcrease blood pressure. Ang II acts on the adrenal cortex to increase the secretion of aldosterone. The levels of ANG in plasma or local tissues diïectly contribute to the levels ofAng II. Therefore the studies of regulation ofANG gene expression is important to understand the molecular mechanisms of some related diseases, such as hypertension. Previous studies m which the transfection of the fusion genes that were generated with various lengths of 5'-flanking region of the rat ANG gene linked to a bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene as a reporter into mouse hepatoma (Hepa 1- 6) ceUs and opossum kidney (OK) cells, identified a putative cyclic AMP responsive element (CRE) in the rat ANG gene 5'-regulatory region (N-806/-779). Compared with palindromic CRE octamer (TGACGTCA), the putative CRE of the ANG gene (ANG-CRE) is almost identical except the last two bases were in reversed order (TGACGTAC). In the present study, we isolated a fuU-length cDNA of 1345 base pairs from mouse liver cDNA library, which encodes a nuclear DNA-binding protein consisting of 436 amino acids with an apparent molecular weight of 52 kilodalton (kDa). This protein binds to the ANG-CRE, and was designated as 52-kDa protein. Southwestern blot revealed that this 52 kDa protein was present in the following tissues, such as liver, kidney, testis, brain, but not in spleen. Analysis of the deduced amino acid sequence shows no apparent basic regionleucine zipper (bZIP) stmcture, indicatmg ANG-CREB is structurally distinct fi-om bZIP family members. The antiserum against 43-kDa-CREB or ATF-2 can not interact with this 52-kDa protein, further supporting that the 52-kDa protem is immunologically different fi-om the bZIP family. The 52-kDa protein may represent a new group of CRE-binding proteins. Competitive gel mobility shift assays and Southwestern blot analysis revealed that the ANG-CREB binds to ANG-CRE, and this bindmg is not displaceable by excess amounts of CREs fi-om somatostatin (SOM), phosphoenopymvate carboxyl kmase PEPCK), and tyrosine ammo transferase (TAT) genes in vitro. These data suggest that the 52-kDa protein binds specifically to ANG-CRE and may regulate the ANG gene expression. The biological function of the 52-kDa protein is not known at present. The primary data from transient gene transfection assays showed that this protein has represser activity on the ANG gene promoter when ANG gene was stimulated by isoproterenol, but showed no effect on the ANG basal level (without any stimulation). Further experiments will be needed to study the biological function of the 52-kDa protein.

L'angiotensinogène (ANG) est une glycoprotéine fonnée de 452 acide aminés chez l'humain (453 acide aminés chez les rongeurs). Une protéase acide, la rénine, clive l'ANG de son côté N-tenninal en libérant un peptide de 10 acide aminés connu sous le nom de l'angiotensine I (Angl). Ce dernier, peut être converti en angiotensine II (AngII) sous Faction d'une enzyme de conversion dite ACE. L'Ang II est un puissant vasocoiisticteur. Il agit au niveau du cerveau en augmentant la pression sanguine et au niveau du cortex rénal en augmentant la sécrétion de l'aldostérone. Les niveaux de l'ANG daiis le plasma ou dans les tissus locaux sont directement proportionnels aux niveaux de Ang II. Ainsi les études de regulation de l'expression du gène d'Ang II sont importantes pour comprendre les mécanismes moléculaires de certames maladies, comme l'hypertension. Des études antérieiu-es par transfection en utilisant des gènes de fusion générés avec différentes longueurs de région flanquées en 5' du gène ANG de rat lié au gène rapporteur de bactérie, le chloramphénicol acetyl transférase (CAT), dans les ceUules hépatome (Hepa 1-6) de souris et dans les ceUules rénales de sarigue, ont permis d'identifier un présumé élément réponse (CRE) d'AMP cyclique dans la région régulatrice en 5' du gène ANG de rat (N- 806/-779). En comparant l'octamère palindromique de CRE (TGACGTCA) avec le présumé CRE du gène ANG (ANG-CRE), il semble qu'ils sont identiques à l'exception des deux dernières bases qui sont dans un ordre inversé (TGACGTAC). Dans cette étude, nous avons isolé à partir d'une banque de cDNA du foie de souris, une cDNA de 1345 paire de bases qui code pour une protéine de liaison à l'ADN nucléaire. Cette protéine est fonnée de 436 acide aminés avec un poids moléculaire apparent de 52 kilodalton (kDa). En se liant à ANG-CER, cette protéme est désignée comme la 52-kDa protéine. Le "Southwestern blot" a révélé que la 52-kDa protéine de 52 kDa est présente dans les tissus suivants: foie, rein, testicule et cerveau; mais absente dans la rate. L'analyse de cette séquence déduite d'acide aminés ne montre pas du stmcture apparent à la région basique de la fermeture éclaire à leucine, bzip (basic region-leucme zipper), indiquant que la 52-kDa protéine est structurellement distincte des membres de la famille bzip. L'antisérum dérigé contre le 43- kDa-CREB ou contre ATF-2 n'intéragit pas avec la 52-kDa protéme confermant amsi que la 52-kDa protéine est immunologiquenient dififérente des membres de famille bzip. La 52-kDa protéine représente donc, un nouveau groupe des protéines de liaison à CRE. Les essais sur gel à mobilité compétitive et les analyses de "southwestern blot" ont révélé que la 52-kDa protéine lié ANG-CRE et que cette liaison n'était pas déplaçable par un excès du gène CRE de somatostatin (SOM), phosphoenopymvate carboxy kmase (PEPCK) et tyrosme ammo transférase (TAT) m vitro, suggérant que la 52-kDa protéine se lié spésifiquement à ANGCRE et qu'il peut réguler l'expression du gène ANG. Les fonctioiis biologiques de la 52- kDa protéine ne sont pas encore connus. Les premiers résultats obtenus à partir des essais de transfections des gènes transitoirs montrent que cette protéine a une activité represseur sur le promoteur du gène d'ANG quand ce dernier est stimulé par l'isoprotérénol, et que, sans stimulation, elle a aucun effet sur le niveau basai d'ANG. Les expériences futures seront nécessaires poiir étudier les fonctions biologiques d'AND.