Caractérisation moléculaire des petites protéines G de la famille Rho dans le rein

Abstract

Les petites protéines G de la famille Rhô jouent un rôle primordial dans l'organisation de la morphologie cellulaire qu'elles accordent aux besoins de la cellule. Elles constituent également une voie importante de signalisation vers le noyau, participent à la régulation du cycle cellulaire et sont impliquées lors du phénomène apoptotique. Ces protéines oscillent entre un état inactif lié au G DP et un état actif lié au GTP. Le passage de l'un à l'autre est assisté par des protéines stimulant (GDS) ou inhibant (GDI) l'activité d'échange des nucléotides et par des protéines stimulant leur activité GTPasique (GAP) intrinsèquement faible. Ce cycle d'activation s'accompagne d'un cycle de localisation, les protéines Rhô étant actives à la membrane et inactives dans la fraction soluble. La protéine GDI, elle-même cytosolique, sert de navette aux protéines Rhô lors de leur transit cytoplasmique. Nous avons caractérisé l'activité de solubilisation des protéines Rhô par la protéine de fusion GST-GDI in vitro, utilisant comme modèle les membranes à bordure en brosse rénales. Deux petites protéines G de ta famille Rhô, RhoA et Cdc42, sont spécifiquement extraites en présence de GST-GDI. Cette activité d'extraction est cependant saturable. Une fraction importante (près de 50%) des protéines RhoA et Cdc42 ne peut être extraite suggérant la présence de sous-populations membranaires. L'activité de solubilisation des protéines Rhô par GST-GDI s'est avérée sensible à la force ionique et est complètement inhibée en conditions physiologiques de température et de sel. La présence de set n'empêche pas la liaison des protéines Rhô à GST-GDI puisque les complexes GST-GDI/Rho coprécipitent sur billes de glutathion-sépharose, en milieu de force ionique physiologique. D'autre part, un prélavage des membranes avec une solution saline inhibe l'extraction subséquente des Rhô par GDI, suggérant fortement qu'un facteur essentiel soit inhibé ou perdu lors du traitement. Ces faits suggèrent que la translocation des protéines Rhô par GDI soit normalement inhibée in vivo et nous amènent à proposer un modèle de régulation de leur cycle d'activation. Nos travaux ont également mis en évidence une protéolyse de GSTGDI au cours des essais d'extraction en présence de membranes à bordure en brosse rénales. Le phénomène est observé en présence de quelques autres tissus et dans tous les cas, un fragment protéolytique majeur de 17 kDa est généré, révélant la présence d'une zone de vulnérabilité protéotytique sur GDI. Le fragment ne peut extraire les Rhô des membranes, suggérant que l'activité GDI puisse être régulée par protéolyse. L'intégrité de GST-GDI est préservée en présence de Ac-YVAD-CHO, un inhibiteur spécifique de caspases. Le séquençage du fragment généré a cependant révélé que le site de coupure sur GST-GDI ne correspond pas à un site d'activité caspase. Ces faits suggèrent que l'activité des protéines Rhô puisse être régulée par une cascade protéolytique incluant une caspase endogène à la membrane à bordure en brosse rénale. D'autre part, notre étude de la stimulation par le GTPyS d'une activité de carboxyméthylation des protéines du rein a démontré que l'activité stimulée implique une isoaspartyle métyltransférase (PIMT). Cette enzyme catalyse le transfert de groupements méthyles provenant du S-adénosyl-Lméthionine, vers la fonction carboxylique portée par la chaîne latérale de résidus isoaspartyles. La PIMT est réputée participer à la réparation de protéines endommagées issues de modifications spontanées de résidus asparagines et aspartates. L'effet stimulateur du GTPyS sur l'activité PIMT est modulé par le vanadate et complètement inhibé par la génistéine et le tyrphostin. L'analyse des profils de méthylation sur gel révèle des modes d'action différents. La génistéine prévient l'accroissement du rythme des cycles de méthylation/déméthylation sur l'ensemble des substrats tel qu'observé habituellement en présence de GTPyS, tandis que le tyrphostin agit plutôt en bloquant une étape de déméthylation. Les résultats obtenus en présence de vanadate et de génistéine suggèrent fortement l'implication d'une activité tyrosine kinase lors de la stimulation de l'activité PIMT par le GTPyS au niveau du rein.