Développement d'un système analytique pour la digestion de protéines, la séparation et la détection de fragments peptidiques

Abstract

La cartographie peptidique est une technique comparative couramment utilisée pour l'analyse des protéines et l'identification de substitutions d'acides aminés ou de modifications post-transductionnelles dont certaines sont à l'origine de maladies graves comme l'anémie. Cette technique est constituée de trois étapes: le clivage enzymatique ou chimique de la protéine, la séparation et la détection des fragments peptidiques par une technique chromatographique. La cartographie peptidique de protéines provenant d'échantillons biologiques est une technique longue et fastidieuse. Afin de digérer les protéines, nous avons mis au point un microréacteur qui contient de la trypsine immobilisée sur un support solide. La solution de protéine est perfusée à travers le microréacteur où a lieu la digestion. Les fragments peptidiques sont collectés à la sortie du micro-réacteur et séparés par électrophorèse capillaire (CE). Ce microréacteur a montré une bonne reproductibilité des cartes peptidiques pour des concentrations de protéines assez élevées (0.08 mM). Cependant, le nombre de pics obtenus sur nos électrophérogrammes dans le cas de la [3-caséine est supérieur au nombre de peptides attendus. Nous avons montré que ce phénomène est dû au fait que les échantillons commerciaux de cette protéine comportent plusieurs isoforrnes. Dans les échantillons biologiques, les fragments peptidiques issus de la digestion de protéines sont souvent présents à des concentrations inférieures aux limites de détection usuelles par spectrophotométrie. Nous avons donc fabriqué un préconcentrateur fait de billes d'octadécylsilane (1 mm x 370 lm). Dans un premier temps, la solution de fragments peptidiques est perfusée à travers le préconcentrateur où les peptides sont retenus. Après connexion de celui-ci à un capillaire de séparation par électrophorèse capillaire, la désorption est effectuée en injectant à travers le préconcentrateur un petit volume d'une solution d'acétonitrile (65 n1). Ce volume d'élution est ensuite poussé par pression dans le capillaire de séparation. Pour éviter les problèmes associés à la présence du préconcentrateur lors de la séparation, ce dernier est déconnecté du capillaire de séparation avant application du voltage. Nos études ont montré que l'étape de préconcentration induit un phénomène chromatographique qui se superpose à la séparation électrophorétique. En conséquence, les cartes peptidiques obtenues avec une étape de préconcentration sont très différentes de celles obtenues à des concentrations élevées. En dépit de ce phénomène, nous avons obtenu des cartes peptidiques de digestats de la [3-caséine avec une bonne reproductibilité et avec des solutions de protéine à des concentrations de 400 nM. Afin de minimiser la perte d'échantillon, les manipulations et le temps nécessaires pour obtenir la cartographie peptidique à partir de la solution de protéine à basse concentration, nous avons connecté le microréacteur, le préconcentrateur et le capillaire de séparation en un système continu. Malgré la perte de résolution et d'efficacité induite par le design du système et le relativement important volume de désorption injecté (60 n1), nous avons atteint un facteur de préconcentration de 500. Nous avons obtenu les cartes peptidiques de différentes protéines à des concentrations allant de 400 nM à 800 nM en quatre heures et ce de manière reproductible. De plus, notre système est réutilisable.