Analyse génétique de l'activité immortalisante de l'antigène grand T du virus du polyome murin

Abstract

Nous avons analysé l'activité immortalisante de l'anugène grand T du virus du polyome marin. Landgène grand T du virus du polyome est en mesure d'interagir avec pRb in vitro et son activité immortalisante semble dépendre de sa capacité à lier pRb par le biais d'une séquence contenue entre les acides aminés 141-146. Cette région contient la séquence consensus de liaison à pRb (D/N-L-X-C-X-E) et est homologue à la région conservée 2 de la protéine E1A d'adénovirus qui est non seulement capable d'interagir avec pRb mais aussi avec la protéine pl 07 et pl 30. Dans un premier temps, nous avons ciblé la région conservée 2 de l'antigène grand T du virus du polyome. Nous avons démontré que la région conservée 2 de l'antigène grand T du virus du polyome est nécessaire pour la liaison de pRb, pl 07 et pl 30 in vitro. Nous avons ensuite examiné la nature des interactions entre pRb, pl 07 et la région conservée 2 de l'amigène grand T du virus du polyome marin et corrélé la formation de complexes avec l'aaivité immortalisante de la protéine. Pour ce faire, nous avons généré une série d'antigènes grand T mutants dans la région conservée 2 en introduisant des mutations ponctuelles au coeur de la séquence consensus de liaison à pRb et dans sa région C-terminale. Ces antigènes grand T mutants nous ont permis de démontrer que chaque acide aminé conservé du coeur de la séquence consensus de liaison à pRb (D/N-L-X-C-X-E) est absolument nécessaire pour la liaison de pRb et de pl 07 in vitro. De plus, la substitution de résidus non-conservés dans la région flanquant le coeur de la séquence de liaison à pRb peut aussi influencer la liaison de pRb et de pl 07 à l'antigène grand T de polyome in vitro. Les antigènes grand T mutants incapables de former des complexes avec pRb à des niveaux significatifs in vitro, sont également incapables d'immortaliser des cultures primaires de fibroblastes embryonnaires de rat in vivo. Nos résultats suggèrent que la liaison de pl 07 nest pas nécessaire pour conférer à l'antigène grand T de polyome l'habileté à immortaliser des cellules primaires de rat. Nous avons donc pu démontrer qu'il y a une corrélation étroite entre la capacité de l'antigène grand T de polyome à lier pRb in vitro et à immortaliser des cellules embryonnaires de rat in vivo. Cependant le niveau absolu de liaison de pRb et de pl 07 in vitro par l antigène grand T n'a aucune influence sur l'activité IV 0 immortalisante de la protéine in vivo mais semble plutôt afFeaer les caractéristiques de croissance des lignées cellulaires dérivées de ces transfections en leur permettant d'atteindre de plus fortes densités de saturation. Nous avons aussi démontré l'importance du motif de phosphorylation par la CKII, flanquant la séquence consensus de liaison à pRb, dans l'activité immortalisante de l'antigène grand T du virus du polyome. Ainsi, l'addition de résidus acides dans ce motif vient doubler la fréquence d'immonalisation de la molécule hybride. De plus, nous avons démontré que la région conservée 2 de l'antigène grand T de SV40 peut remplacer la région conservée 2 de l'antigène grand T du virus du polyome marin. La molécule hybride est en mesure d'immortaliser des cellules embryonnaires de rat à une fréquence équivalente à l'antigène grand T de polyome sauvage. La deletion des acides aminés correspondant à la position du domaine de liaison à pRb chez l'antigène grand T de SV40 génère un antigène grand T mutant qui est en mesure d'immortaliser des cellules embryonnaires de rat à une fréquence deux fois plus élevée que l'anrigène grand T sauvage. Les lignées cellulaires dérivées des transfections avec ces trois antigènes grand T mutants possèdent des phénotypes particuliers. Ces lignées cellulaires sont toutes en mesure de former des colonies en agar mou à une fréquence élevée. L'ensemble de nos résultats révèle une corrélation intéressante entre la capacité de lier les protéines pRb et pl 07 in vitro et l'activiré immortalisante de l'antigène grand T de polyome in vivo. En efFet, les antigènes grand T mutants capables de lier pRb à des niveaux équivalents ou supérieurs à la protéine sauvage et dont la capacité de lier pl 07 est diminuée, démontrent tous une fréquence d'immortalisation supérieure à l'anugène grand T sauvage. Ces observations nous amènent à suggérer un modèle d'immortalisation cellulaire par l'anrigène grand T de polyome où le rapport entre la quantité de pRb et de pl 07 lie par l'antigène grand T du virus du polyome pourrait avoir un effet sur l'activité immortalisante de la protéine. u v 0 Dans la troisième partie de cette étude, nous avons examiné la contribution du motif de doigt de zinc à l'activité immortalisante de l'antigène grand T de polyome. Un fragment N-terminal de 219 acides aminés est en mesure d'immonaliser des cellules embryonnaires de rat mais à une fréquence équivalente à seulement 22% de l'antigène grand T sauvage. La formation de complexes de hauts poids moléculaires, qui nécessite le motif de doigt de zinc, pourrait être importante pour la pleine activité immortalisante de la protéine. Nous avons delete le motif de doigt de zinc de l'antigène grand T de polyome et déterminé l'activité immortalisante de la protéine in vivo. Nos résultats indiquent que la deletion du motif de doigt de zinc ne diminue pas la capacité de l'andgène grand T mutant à immortaliser des cellules embryonnaires de rat mais augmente plutôt sa fréquence relative d'immortalisation. Le motif de doigt de zinc n'est donc pas nécessaire pour l'immortalisation de cultures primaires de cellules embryonnaires de rat. Ces résidtats suggèrent que d'autres domaines de la protéine sont néoessaires pour conférer à l'antigène grand T de polyome sa pleine activité immortalisante.