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dc.contributor.advisorPelletier, Joelle
dc.contributor.authorFossati, Elena
dc.date.accessioned2009-07-06T18:15:14Z
dc.date.availableNO_RESTRICTIONen
dc.date.available2009-07-06T18:15:14Z
dc.date.issued2009-06-04
dc.date.submitted2008-11
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/1866/2894
dc.subjectdihydrofolate réductases humaineen
dc.subjectméthotrexateen
dc.subjectpemetrexeden
dc.subjectrésistance aux médicamentsen
dc.subjectmutagenèseen
dc.subjectévolution dirigéeen
dc.subjectcriblage à haut débiten
dc.subjectrelation structure-fonctionen
dc.subjectcinétique enzymatiqueen
dc.subjectmodélisation moléculaireen
dc.subjecthuman dihydrofolate reductaseen
dc.subjectmethotrexateen
dc.subjectpemetrexeden
dc.subjectdrug-resistanceen
dc.subjectsaturation and combinatorial mutagenesisen
dc.subjectdirected evolutionen
dc.subjecthigh-throughput screeningen
dc.subjectstructure-function relationshipen
dc.subjectenzyme kineticsen
dc.subjectmolecular modelingen
dc.subject.otherChemistry - Biochemistry / Chimie - Biochimie (UMI : 0487)en
dc.titleDirected evolution of human dihydrofolate reductase: towards a better understanding of binding at the active siteen
dc.typeThèse ou mémoire / Thesis or Dissertation
etd.degree.disciplineBiochimieen
etd.degree.grantorUniversité de Montréal (Faculté de médecine)fr
etd.degree.levelMaîtrise / Master'sen
etd.degree.nameM. Sc.en
dcterms.abstractLa dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand.en
dcterms.abstractHuman dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.en
dcterms.languageengen


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