Étude structurale, biomécanique et génétique des interactions cellulaires avec une surface de titane modifiée à l’échelle nanométrique
Thèse ou mémoire
Résumé·s
Le titane (Ti) est largement utilisé en orthopédie et médecine dentaire. Ce matériau présente d´excellentes propriétés mécaniques, est biocompatible et résiste à la corrosion. L’interaction entre les cellules et la surface d’un implant joue un rôle décisif dans l’ostéointégration. Malgré la grande variété d’études que nous trouvons dans la littérature, le comportement des cellules en contact avec des matériaux implantables comme le Ti n’est toujours pas élucidé à toutes les échelles topographiques. Notre laboratoire a développé une méthode de modification physico-chimique de la surface de métaux à intérêt médical. Cette méthode génère des surfaces nanoporeuses qui favorisent la différenciation de cellules souches, affectent le comportement cellulaire de façon différentielle, promeuvent la formation osseuse in vitro et in vivo, et qui ont une capacité antibactérienne.
Afin de mieux comprendre comment cette surface influence le comportement cellulaire, nous avons étudié leur influence sur la formation et la maturation des adhésions focales (FAs, de l’anglais) et la formation des filopodes. De plus, nous avons examiné comment les caractéristiques physico-chimiques de la surface obtenue guident l’expression génique des protéines associées aux FAs et aux filopodes en utilisant différentes lignées cellulaires. Finalement, afin de mieux comprendre la biomécanique de la cellule, la force d’adhésion à la surface des filopodes a été déterminée à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM).
Des disques de Ti commercialement pur (Cp-Ti) ont été polis a fini miroir (Ti-Control), une partie des disques a été traité avec un mélange d’acide sulfurique et de peroxyde d’hydrogène pour créer une surface nanostructurée poreuse (Ti-Nano). L’influence de la nanoporosité, de la cristallinité et la mouillabilité de cette surface sur des cellules pre-ostéoblastiques de souris (MC3T3) et des bactéries a été évalué par la microscopie électronique à balayage (MEB) et par immunofluorescence (IF). Nous avons ensuite utilisé une lignée cellulaire épithéliale (CHO-K1) qui exprime la paxilline (une protéine des FAs) de type sauvage ou la paxilline avec des mutations. De plus, la force d’interaction des filopodes avec la surface a été quantifié en mesurant la force latérale nécessaire pour les déplacer avec une pointe d’AFM. Finalement, la centrifugation a été utilisée pour étudier les changements fonctionnels des cellules MC3T3.
L’analyse du comportement des cellules MC3T3 sur des surfaces amorphes et cristallines n'a pas montré de différence par rapport au nombre des cellules ou la quantité des FAs. La cristallinité de la couche superficielle n’avait également aucune incidence sur l’adhésion bactérienne. Les deux lignées cellulaires utilisées ont montré une présence abondante de filopodes avec des nanoprotrusions latérales en réponse à la nanoporosité. La taille et la forme des cellules CHO-K1 ont été grandement affectées par la topographie. L’expression génique des protéines associées aux différents marqueurs des FAs et aux protrusions a été aussi significativement augmentée sur la surface nanoporeuse, quel que soit le type de cellule. Les filopodes sur Ti-Nano ont montré une plus grande résistance au détachement latéral, ce qui indique qu'ils adhèrent à la surface avec plus de force. Également, l’analyse par MEB a révélé une restructuration de la membrane cellulaire accompagnée d’un changement de la forme cellulaire après centrifugation. Parce que les mitochondries fournissent de l’énergie pour les processus cellulaires, l’organisation du réseau mitochondrial a été influencée aussi par la topographie de surface et la centrifugation. Bien qu’il ne puisse pas être exclu que la cristallinité et la mouillabilité de la surface contribuent dans une certaine mesure à déterminer le comportement des cellules, nos résultats suggèrent que les caractéristiques physiques des surfaces représentent le principal déterminant. Nous avons démontré aussi, pour la première fois, que la topographie de surface peut modifier l’interaction adhésive d’une structure subcellulaire qui est fondamentale dans la détection des caractéristiques physico-chimiques des surfaces. En conclusion, nos résultats montrent que la topographie de surface peut modifier des propriétés fondamentales dans les cellules. Dans leur ensemble, ils soulèvent la possibilité que les surfaces nanostructurées puissent être utilisées non seulement pour guider/accélérer l’intégration de biomatériaux dans des conditions normales, mais également dans des situations où l’activité cellulaire est compromise ou également pour les prothèses soumises à des charges externes, telles que les implants orthopédiques et dentaires. Titanium (Ti) is widely used in orthopedics and dentistry. This material has excellent
mechanical properties, is biocompatible and corrosion resistant. The interaction between the cells
and the surface of an implant plays a key role in osseointegration. Despite the wide variety of
studies found in the literature, the behavior of cells in contact with implantable materials such as
Ti is not yet fully elucidated at all topographic scales. Our laboratory has developed a method for
the physicochemical modification of the surface of medically relevant metals. This method
generates nanoporous surfaces that promote stem cell differentiation, differentially affect cellular
behavior, promote bone formation in vitro and in vivo and have antibacterial capacity.
To better understand how this surface influences cell behavior, we studied their influence
on the formation and maturation of focal adhesions (FAs) and filopodia formation. Furthermore,
we examined how the physicochemical characteristics of the resulting surface guide the gene
expression of proteins associated with FAs and filopodia using different cell lines. Finally, to better
understand the biomechanics of the cell, the adhesion strength of filopodia to the surface was
determined using atomic force microscopy (AFM).
Commercially pure Ti discs (Cp-Ti) were polished to a mirror finish (Ti-Control), some of
the polished discs were treated with a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide to create a
nanostructured surface (Ti-Nano). The influence of nanoporosity, crystallinity and wettability of
this surface on mouse pre-osteoblastic cells (MC3T3) and bacteria was evaluated by scanning
electron microscopy (SEM) and immunofluorescence. Then, to evaluate the response to
nanotopography, we used an epithelial cell line (CHO-K1) that expresses wild type paxillin (a
protein of FAs) or paxillin with mutations. In addition, the interaction forces of the filopodia with
the surface were quantified by measuring the lateral force required to displace these structures from
the surface with an AFM tip. Finally, centrifugation was used to study functional changes in
MC3T3 cells.
Analysis of the behavior of MC3T3 cells on amorphous and crystalline surfaces showed no
difference in cell number or the number of focal adhesions. The crystallinity of the surface layers
also had no effect on bacterial adhesion. Both cell lines used showed abundant presence of filopodia
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with lateral nanoprotrusions in response to nanoporosity. The size and shape of CHO-K1 cells was
greatly affected by the topography. Gene expression of proteins associated with different focal
adhesion markers and protrusions was also significantly increased on the nanoporous surface,
regardless of cell type. Filopodia on the Ti-Nano showed greater resistance to lateral detachment
force, indicating that they adhere to the surface with greater strength. Also, SEM analysis revealed
a restructuring of the cell membrane accompanied by a corresponding change in cell shape after
centrifugation. Because mitochondria provide energy for cell processes, the organization of the
mitochondrial network was also influenced by surface topography and centrifugation. Although it
cannot be excluded that surface crystallinity and wettability contribute to some extent to
determining cell behavior, our results suggest that the physical characteristics of the surfaces
represent the main determinant. We have also shown for the first time that surface topography can
modify the adhesive interaction of a subcellular structure that is fundamental in the detection of the
physicochemical characteristics of surfaces. In conclusion, our results show that surface
topography can modify fundamental properties in cells. Together, they raise the possibility that
nanostructured surfaces can be used not only to guide/accelerate the integration of biomaterials
under normal conditions, but also in situations where cellular activity is compromised or also for
prostheses under external loads, such as orthopedic and dental implants.
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