Identifying regulators of hepatic leukemia factor (HLF) expression in hematopoietic cells using a fluorescent reporter transgene

Abstract

Le facteur de leucémie hépatique (HLF) est un facteur de transcription et l’un des gènes les plus sélectivement exprimés par les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) humaines et de souris. L’expression de HLF identifie l’activité fonctionnelle des CSHs et est un gène clé du caractère souche maintenant la quiescence et l’auto-renouvellement. Une surexpression de HLF a été observée dans les sous-groupes de leucémie myéloïde aiguë (LMA) comportant des mutations des gènes NPM1 (NPM1c) et FLT3 (FLT3-ITD), et il a été suggéré que ceci protège contre la mort cellulaire et les traitements chimio-toxiques. Cependant, la voie de signalisation responsable de la surexpression de HLF dans les leucémies avec mutation NPM1c reste inconnue. Puisque l’expression de HLF est associée à l’activité CSH et diminue au moment de la différentiation, nous avons émis l’hypothèse que la fusion du gène HLF avec un gène rapporteur fluorescent (HLF-ZsG) dans une lignée de cellules leucémiques (IMS-M2) pourrait être utilisée pour identifier les gènes qui régulent l’expression de HLF dans les CSHs normales. La protéine NPM1 réside dans le noyau et régule la réparation de l’ADN, la croissance cellulaire et la prolifération. Des mutations qui entraînent sa localisation cytoplasmique (NPM1c) ont été observées dans la LMA, entraînant une prolifération et une différenciation aberrante des cellules. La relocalisation nucléaire de la protéine NPM1c entraîne la régulation à la baisse des gènes homéotiques dans les cellules IMS-M2. Nous avons validé l’expression de la fusion HLF-ZsG dans les cellules IMS-M2 et confirmé la dépendance de l’expression de HLF à NPM1c. De plus, nous avons identifié MEIS1, HOXA10 et NKX2-3 comme étant des régulateurs potentiels de HLF. Nous avons également identifié un réseau régulant l’expression de HLF en aval de NPM1c aidant à comprendre les mécanismes de régulation de HLF dans les CSHs normales.

Hepatic leukemia factor (HLF) is a transcription factor and one of the most selectively expressed genes in human and mouse hematopoietic stem cells (HSCs). HLF identifies functional HSC activity and is a key “stemness” gene that maintains quiescence and self-renewal. Upregulation of HLF has been observed in NPM1c/FLT3-ITD-mutated acute myeloid leukemia (AML) and is thought to protect cells from death and chemotoxic insults. However, the pathways which cause HLF expression in NPM1c-mutated leukemia are unknown. Since HLF expression is associated with HSC activity and decreases upon differentiation, we hypothesized that an HLF-ZsG fluorescent reporter in a leukemia cell line (IMS-M2) could be used as a readout to identify genes that regulate HLF in normal HSCs. The NPM1 protein resides in the nucleus and regulates DNA repair, cell growth and proliferation. Mutations which result in its cytoplasmic localization (NPM1c) have been observed in AML and lead to aberrant cell proliferation and differentiation. Nuclear relocalization of NPM1c results in the downregulation of homeobox genes in IMS-M2 cells. We validated the HLF-ZsG reporter in IMS-M2 cells and confirmed the dependency of HLF expression on NPM1c. We then identified MEIS1, HOXA10 and NKX2-3 as potential regulators of HLF. We have identified a preliminary network of HLF expression downstream of NPM1c, which may also help us understand HLF regulation in normal HSCs.