Analyse du rôle des Cystéines dans l’activation de l’adaptateur MAVS lors de l’infection par le virus de Sendai

Abstract

Mitochondrial antiviral-signaling protein (MAVS) joue un rôle central dans la réponse immunitaire innée, où elle permet la coordination de multiples cascades de signalisation conduisant à la production d'Interférons (IFNs) et de cytokines pro-inflammatoires essentiels à la mise en place d'un état antiviral. MAVS est strictement régulée par différents types de modifications post-traductionnelles (PTMs), telles que la phosphorylation et l’ubiquitination. Les PTMs oxydatives réversibles (ox-PTMs) des thiols des cystéines (Cys) jouent un rôle majeur dans la régulation de la signalisation cellulaire. Notre groupe a observé que l’infection par un virus à ARN, le virus Sendai (SeV), induit des Cys ox-PTMs de MAVS. Notre objectif est d'étudier le rôle des Cys de MAVS potentiellement oxydables dans son activation lors d’une infection par un virus à ARN modèle, le SeV. Pour étudier l'implication des modifications Cys sur la fonction de MAVS, des mutants Cys/Alanine (Ala) et Cys/Phénylalanine (Phe) englobant les Cys contenus dans le domaine CARD N-terminal de MAVS et proche de celui-ci ont été générés. Nous avons constaté que dans les cellules A549 déficientes en MAVS transfectées transitoirement par le mutant de toutes les Cys du domaine CARD (C13/20/33/46A), le mutant C79F proche de celui-ci, les mutants C13/33A, C13/20/33A et C13/33/46A, l’activité du promoteur de l’IFNB est inhibée. Nous avons donc généré des cellules A549 déficientes en MAVS transfectées stablement par ces constructions. Nous avons observé que la signalisation antivirale en aval de MAVS a été totalement abolie pendant l’infection SeV dans les cellules exprimant C13/20/33/46A, C79F, C13/20/33A et C13/33/46A. Cette perte de signalisation se traduit par l’absence de phosphorylation de TBK1 et du facteur de transcription IRF3 ainsi que l’inhibition de la production de la protéine antivirale IFIT1. Ultimement cela résulte en une diminution significative de l’activation du promoteur de l’IFNB. Le double mutant C13/33A présente un phénotype d’activité intermédiaire. Globalement, nous proposons un modèle dans lequel au moins 3 résidus Cys dans le domaine CARD de MAVS et/ou la Cys79, dont l’oxydation est essentielle à l’activité de MAVS en régulant probablement ses interactions, sa polymérisation, sa localisation ou ses autres PTMs. Cette étude servira à caractériser un nouveau mécanisme régulateur de la réponse antivirale contre les virus à ARN et à développer des stratégies antivirales visant ce mécanisme.

Mitochondrial antiviral-signaling protein (MAVS) plays a central role in the innate immune response, allowing the coordination of multiple signaling cascades ultimately leading to the production of interferons (IFNs) and pro-inflammatory cytokines that are essential to mount an antiviral state. MAVS is tightly regulated by different types of post-translational modifications (PTMs) such as phosphorylation and ubiquitination. Reversible oxidative PTMs (ox-PTMs) of cysteine thiols (Cys) play a major role in the regulation of cell signaling. Our group observed that infection with an RNA virus, Sendai virus (SeV) induces ox-PTMs of MAVS Cys. Our goal is to investigate the role of the Cys of MAVS that are potentially oxidized in its activity during infection with a model of RNA virus, SeV. In order to determine the involvement of Cys modifications on MAVS function, Cys/Alanine (Ala) and Cys/Phenylalanine (Phe) mutants encompassing Cys contained within and close to the N-terminal CARD domain of MAVS were generated. We found that in MAVS-deficient A549 cells transiently transfected with the mutant of all Cys in the CARD domain (C13/20/33/46A), the C79F mutant close to it, the C13/33A, C13/20/33A and C13/33/46A mutants, IFNB promoter activity is inhibited. We therefore generated MAVS-deficient A549 cells stably transfected with these constructs. We observed that antiviral signaling downstream of MAVS was completely abolished during SeV infection in cells expressing C13/20/33A, C79F, C13/20/33A and C13/33/46A. This dampening of the capacity of signaling include absence of phosphorylation of TBK1 and the transcription factor IRF3 as well as the inhibition of the production of antiviral protein IFIT1. These events ultimately result in a significant decrease of IFNB promoter activation. The C13/33A double mutant exhibits an intermediate phenotype of antiviral activity. Altogether, we propose a model in which at least 3 Cys residues within the CARD domain of MAVS and/or the Cys79, whose potential reversible oxidation is essential for MAVS antiviral response, probably by regulating its interactions, polymerization, localization or its other PTMs. This study will help to characterize a new regulatory mechanism of the antiviral response against RNA viruses and to develop antiviral strategies targeting this mechanism.