Deciphering intron structural organization and metabolism using super-resolution microscopy
Thesis or Dissertation
Abstract(s)
Les pré-ARNm contiennent des régions codantes pour les protéines et des introns non codants. L'épissage élimine les introns du pré-ARNm et lie les exons pour former des ARNm matures. Les introns excisés sont dégradés rapidement, et la fonction de l'enzyme de débranchement des lassos de l'ARN (Dbr1) constitue une étape limitante de la dégradation et de l’organisation des introns.
De nouveaux rôles surprenants de Dbr1 ont été identifiés dans le métabolisme cellulaire, au-delà des processus de renouvellement des introns, allant de la régulation de l'épissage au contrôle de la traduction. Le premier objectif de mes recherches, se concentre sur la dégradation du lasso effectuée par Dbr1 et cherche à comprendre si l'accumulation de lassos déclenche une réponse immunitaire innée. Nous avons utilisé le système d'édition de gènes CRISPR/Cas9 pour introduire dans des cellules HCT116 un système de dégradation in situ de Dbr1 étant inductible par de l'auxine. En combinant des techniques de microscopie par immunofluorescence (IF) et des expériences de séquençage de l'ARN, nous identifions deux populations d'introns pour lesquelles la dégradation est dépendante ou indépendante de Dbr1. De plus, nous avons révélé que la déplétion de Dbr1 conduit à l'accumulation d'intron dans le cytoplasme et à la formation d'ARN double brin (ARNdb) co-localisés dans la mitochondrie avec la protéine de signal antiviral mitochondrial (MAVS).
Bien que des efforts récents aient permis de mieux comprendre l'organisation structurelle de certains ARNs dans les cellules, il est difficile de proposer des règles générales qui définissent l'organisation et l'architecture 3D des ARN cellulaires, y compris les introns. Le deuxième objectif, se concentre sur l'organisation des introns et plus précisément sur la question de savoir si l'absence des protéines hétéro-nucléaires de liaison à l'ARN (hnRNP) modifie l'organisation et la distance entre les extrêmtés du dernier intron de POLA1. À l'aide de siRNA nous avons déplété les hnRNP C1/C2, hnRNP A1, hnRNP A2B1 et, en combinaison avec l'hybridation in situ de sonde d'ARN fluorescent sur molécule unique (smFISH), nous avons mesuré les distances entre l'extrémité 5', le milieu et l'extrémité 3' du dernier intron de POLA1. Nos données ont révélé que l'élimination des hnRNP n'affecte pas la distance entre les extrémités du dernier intron de POLA1. Dans l'ensemble, cela suggère qu’il existe un degré élevé de redondance entre hnRNPs dans l'organisation des introns. Pre-mRNAs contain protein-coding regions and non-coding introns. The splicing removes introns from pre-mRNA and ligates exons to form mature mRNAs. Here we studied different aspects of intron metabolism related to intron turnover and structural organization of introns.
Excised introns are turned over rapidly, and the lariat debranching by the RNA lariat debranching enzyme (Dbr1) provides a rate-limiting step in the intron turnover process. Moreover, Dbr1 has been linked to other processes related to cellular RNA metabolism; however, whether these are directly linked to additional functions or Dbr1 or are caused by impaired lariat turnover is still unclear. Therefore, the first aim of my thesis focused on characterizing Dbr1 mediated intron-lariat turnover and investigating phenotypes induced by inactivating the Dbr1 function. To achieve this, we used CRISPR/Cas9 gene-editing system to introduce an auxin-inducible degron system for in situ depletion of the Dbr1 in HCT116 cells. By combining immunofluorescence (IF) microscopy and ribo-depleted RNA-sequencing experiments, we identify two populations of introns for which the turnover is dependent or independent of Dbr1. Moreover, we revealed that Dbr1 depletion leads to an accumulation of intron-lariats in the cytoplasm, possibly as double-stranded RNAs (dsRNAs) localized to the mitochondria colocalizing with mitochondrial antiviral signal protein (MAVS).
Although recent efforts helped to build a picture of the structural organization of RNA in cells, it is currently unclear whether we can propose general rules that define the 3D organization and architecture of cellular RNAs, including introns. How introns are organized and intron RNPs assembled, however, are essential to intron metabolism, including splicing and lariat intron turnover. The second aim focuses on investigating intron structural organization and specifically test whether the absence of the heteronuclear RNA binding proteins (hnRNPs) changes the organization and end-to-end distance, using the last intron of POLA1 as a model. Using siRNA-mediated knockdown of hnRNP C1/C2, hnRNP A1, hnRNP A2B1 and single-molecule fluorescent RNA in situ hybridization (smFISH), we revealed structural intron features of this intron in cells. However, we did not observe changes concerning end-to-end distance after knocking down the above hnRNPs. Altogether, my work suggests a high degree of redundancies between hnRNPs that mediate intron structural organization and Dbr1 debranching activity is not essential for the turnover of all introns.
Collections
This document disseminated on Papyrus is the exclusive property of the copyright holders and is protected by the Copyright Act (R.S.C. 1985, c. C-42). It may be used for fair dealing and non-commercial purposes, for private study or research, criticism and review as provided by law. For any other use, written authorization from the copyright holders is required.