Caractérisation de molécules antibiofilm produites par des souches de staphylocoques isolées dans des cas de mammite bovine

Abstract

Le biofilm bactérien est une communauté de bactéries qui s’agrègent en un amas structuré recouvert d’une matrice polymérique et adhèrent sur une surface biotique ou abiotique. Ce mode de vie permet à ces bactéries de survivre dans un environnement hostile et cela entre autres grâce à une plus grande résistance aux antibiotiques que les bactéries sous forme libre ou planctonique. Les bactéries ayant la capacité de former des biofilms constituent donc un grave problème de santé tout aussi bien pour l’homme que pour l’animal comme par exemple dans le cas de la mammite bovine (MB). La MB est une inflammation de la glande mammaire de la vache induisant des dommages des tissus du pis et de ce fait, une réduction de la production de lait ainsi qu’une altération du bien-être de l’animal. Il est donc important de développer de nouvelles stratégies prophylactiques et thérapeutiques contre la MB. Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire avaient mis en évidence la capacité de certaines souches de staphylocoques à coagulase négative (SCN) produisant peu ou pas de biofilm à inhiber la formation de biofilm par d’autres bactéries responsables de MB. Notre hypothèse était donc que certaines souches faibles productrices de biofilm produisaient une ou plusieurs molécule(s) capable(s) d’inhiber de façon significative la formation de biofilm par d’autres SCN mais également par Staphylococcus aureus et possiblement d’autres agents pathogènes de la MB. Le but de ce projet fut donc de caractériser des molécules antibiofilm produites par des souches de SCN. Pour cela, 30 souches de staphylocoques (cinq espèces de SCN et S. aureus) fortes productrices de biofilm et 10 souches de SCN (Staphylococcus chromogenes et Staphylococcus simulans) faibles productrices de biofilm ont été utilisées. Nos résultats ont montré que certaines souches de SCN présentant un phénotype de faible production de biofilm réduisaient significativement la formation de biofilm chez plusieurs espèces de staphylocoques dont S. aureus. De plus, quatre souches de SCN (S. chromogenes C et E et S. simulans F et H) ont été capables d'inhiber de façon significative (p < 0,05) la formation de biofilm de 80% des souches testées. Cette activité antibiofilm a été également visualisée par microscopie confocale ainsi que dans des conditions dynamiques en utilisant un système de microfluidique. En parallèle, il a été démontré que les souches de SCN présentant un phénotype de faible production de biofilm n'inhibaient pas significativement la croissance des souches ayant un phénotype de forte production de biofilm. Par conséquent, l’activité antibiofilm observée ne semblait pas être due à une activité bactéricide. De plus, nos résultats ont montré que les surnageants de ces quatre souches présentaient également une activité antibiofilm et qu’ils possédaient un spectre d’activité étendu suggérant ainsi que les souches excrétaient une molécule antibiofilm dans son environnement extérieur. La caractérisation de ces surnageants a permis de mettre en évidence que l’activité inhibitrice était notamment conservée dans la fraction des surnageants < 3kDa et qu’une des molécules responsables de cette activité était hydrophile, thermorésistante et sensible à l’action de la RNase A. Enfin, nous avons pu observer que ces surnageants avaient la capacité de réduire voir même de prévenir la colonisation de la glande mammaire par une souche de S. aureus résistante à la méthicilline dans un modèle murin de mammite. Ces surnageants semblent être une alternative prometteuse dans le contrôle de la MB pour prévenir et/ou traiter cette infection que ce soit seul ou en association avec un traitement antibiotique.

Bacterial biofilms are structured communities of bacteria cells enclosed in a selfproduced polymeric matrix which is adherent to a biotic or abiotic surface. This lifestyle allows these bacteria to survive in hostile environments. For example, bacteria having the ability to form biofilms are significantly less susceptible to antibiotics than bacteria in planktonic form. Bacteria within biofilms pose a serious risk to human and animal health such as during bovine mastitis (BM). BM is an inflammation of the mammary gland of dairy cows which causes udder damages and reduces milk production. Therefore, it is important to develop new prophylactic and therapeutic strategies to control and treat BM. Preliminary results have demonstrated the ability of some coagulase-negative staphylococci (CNS) producing a weak biofilm to inhibit biofilm formation by other bacteria associated with BM. Our hypothesis is that some of CNS isolates having the ability to form a weak biofilm produce one or more molecule(s) able to significantly inhibit biofilm formation by other CNS, Staphylococcus aureus or other BM pathogens. The purpose of this project was to characterize antibiofilm molecules produced by CNS isolates. A total of 30 staphylococcal isolates (five species of CNS and S. aureus) with a strong biofilm phenotype and 10 CNS (Staphylococcus chromogenes and Staphylococcus simulans) isolates with a weak biofilm phenotype were used. Our results indicated that some CNS isolates with a weak biofilm phenotype significantly reduced biofilm formation of several staphylococcal species including S. aureus. Importantly, four isolates of CNS (S. chromogenes C and E and S. simulans F and H) were able to significantly inhibit biofilm formation (p < 0.05) of 80% of staphylococcal isolates tested. This activity was confirmed using confocal microscopy but also in dynamic conditions using a microfluidic system. Additionally, CNS with a weak biofilm phenotype did not significantly inhibit the growth of isolates with a strong biofilm phenotype. Therefore, the biofilm inhibition does not seem to be due to a bactericidal activity. The results also showed that the culture supernatants from these four bacteria still have an antibiofilm activity and own a broad spectrum of activity suggesting that the strains release an antibiofilm molecule into the external environment. The characterization of these supernatants indicated that the inhibitory activity was conserved in the < 3kDa fraction of the supernatants. Furthermore, one of the molecules responsible for the antibiofilm activity appears hydrophilic, heat-resistant and sensitive to the action of the RNase A. Finally, we observed that culture supernatants of these bacteria had the ability to reduce or even prevent colonization of the mammary gland by a strain of methicillin-resistant S. aureus in a murine model of mastitis. These supernatants appear to be a promising alternative alone or in combination with antibiotics in the control of BM.