Imagerie moléculaire de l’ARN de la télomérase dans des cellules cancéreuses humaines

Abstract

Les télomères sont raccourcis à chaque cycle de réplication de l’ADN à cause du problème de réplication des extrémités. Leur longueur dicte la capacité proliférative des cellules eucaryotes. Des télomères trop courts, aillant atteints la limite de Hayflick, feront entrer les cellules en sénescence réplicative. Pourtant dans les cellules progénitrices ainsi que 90% des cellules cancéreuses la longueur des télomères est maintenue par un complexe ribonucléoprotéique, la télomérase. L’assemblage de ce complexe ainsi que son recrutement aux télomères son des processus dynamiques sous le contrôle d’une régulation fine. Toutefois, comment cette régulation à un impact sur la dynamique de la télomérase dans le noyau n’est toujours pas complétement compris. Dans ce projet nous avons développé une nouvelle méthode se basant sur le système MS2 permettant d’observer pour la première des particules uniques d’ARN de télomérase (hTR) par microscopie à fluorescence sur cellules cancéreuse humaines vivantes. Le suivi en temps réel de ces particules aux télomères a permis de révéler que la télomérase scanne activement les télomères via des interactions courtes avec la protéine télomérique TPP1. Des interactions plus stables nécessaires à l’allongement des télomères peuvent être formées grâce à l’appariement entre hTR et l’ADN simple brin du télomère sous contrôle du domaine OB-fold de la protéine télomérique POT1. Le suivi de ces particules au cours du cycle cellulaire a révélé que ces interactions ne sont pas restreintes à la phase S, la phase d’élongation des télomères. La mesure de la dynamique de hTR dans les corps de Cajal (CBs) couplé à des expériences de photo-activation ont pu montrer que hTERT joue un rôle dans la sortie de hTR des CBs. Enfin des mesures d’intensités de fluorescence de hTR aux télomères montrent qu’une seule particule est recruté sur un télomère en phase S.

Telomeres are shortened at each DNA replication cycle, due to the end replication problem. Their length dictates the proliferative capacity of eukaryotic cells. Too short telomeres, reaching the Hayflick limit, will lead the cells to replicative senescence. However, in stem cells and 90% of cancer cells telomere length is maintained by a ribonucleoproteic complex named telomerase. The assembly of this complex and its recruitment to telomeres are process under a fine regulation. Yet, how this regulation impacts the nuclear dynamics of telomerase is not fully understood. In this project, we developed a new method based on the MS2 system to image for the first time telomerase RNA (hTR) particles in living human cancer cells by fluorescence microscopy. The real time tracking of these particles at telomeres revealed that telomerase actively scan all telomeres by short interactions with the TPP1 shelterin protein. Long stable interaction needed for telomere elongation can be made by the pairing of hTR template and single stranded telomeric DNA under the control of the OB-fold domains of the shelterin protein POT1. By tracking telomerase particle during the cell cycle, we revealed that telomerase recruitment to telomeres is not restricted to S phase, when telomeres are elongated. By measuring the dynamics of hTR in Cajal bodies (CBs) with photo-activation and photo-bleaching technics we showed that hTERT play a role in the hTR exit from CBS. Finally, fluorescence intensity measures of hTR at telomeres showed the recruitment of only one particle on a telomere.