Un nouveau mécanisme de régulation des complexes épigénétiques BAP1/ASXLs par ubiquitination

Abstract

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle des protéines qui consiste à attacher, d’une manière covalente, le groupement ubiquitine sur un résidu lysine de la protéine cible. Cette modification peut avoir un impact considérable sur la fonction, la localisation et la stabilité de ces cibles. Une fois établie par des enzymes appelées E3 ligases, l’ubiquitination peut être enlevée par des enzymes spécifiques appelées déubiquitinases, modulant ainsi les effets causés par cette modification. BAP1 (BRCA1-Associated Protein 1) est une déubiquitinase de la famille des UCH (Ubiquitin C-terminal Hydrolases) qui a été initialement identifiée comme partenaire du suppresseur de tumeurs BRCA1 (BReast Cancer Associated gene 1). De nombreux groupes de recherche, incluant le nôtre, ont montré que BAP1 est associée avec d’autres cofacteurs formant un large complexe multiprotéique. Ce dernier est impliqué dans plusieurs processus cellulaires comme la transcription des gènes, la régulation de la chromatine, la coordination du cycle cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. La cible majeure de BAP1 est l’histone H2A ubiquitinée sur la lysine 119, une marque d’histone qui a été souvent associée avec une conformation répressive de la chromatine. Quels sont les mécanismes régulant le complexe BAP1 lui permettant d’exécuter ces fonctions biologiques? Cela implique-t-il des modifications post-traductionnelles touchant les partenaires de BAP1 ? Ces questions restent encore sans réponse définitive. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser le mécanisme et la fonction du complexe BAP1 en étudiant les modifications post-traductionnelles de ses partenaires.

Pour répondre à ces questions nous avons étudié les modifications post-traductionnelles touchant BAP1 et ses cofacteurs mutuellement exclusifs ASXL1 et ASXL2 (Additional Sex Comb-like 1,2). Nous avons démontré qu’ASXL1 et ASXL2 sont monoubiquitinés uniquement lorsqu’ils sont associés à BAP1. Sachant que les complexes BAP1/ASXLs sont conservés au cours de l’évolution, nous avons aussi démontré que la monoubiquitination des ASXLs est conservée chez la Drosophile. En utilisant des méthodes de déplétion de protéines par siARN et CRISPR/Cas9 ainsi que des mutants de perte de fonction de BAP1 et ASXL2, nous avons identifié les enzymes responsables de la monoubiquitination des ASXLs ainsi que leur effet sur l’activité catalytique de BAP1. D’autre part, nous avons étudié le développement chez la Drosophile ainsi que le cycle cellulaire des cellules humaines pour identifier la fonction biologique de la monoubiquitination de ASXL2. Nos résultats démontrent que la monoubiquitination d’ASXL2 sur la lysine 370 en présence de BAP1 est une modification post-traductionnelle conservée et catalysée directement par la famille UBE2Es des enzymes de conjugaison de l’ubiquitine (UBE2E1,2,3 chez les mammifères et UbcD2 chez la Drosophile). Cette monoubiquitination stimule l’activité catalytique de BAP1 chez les mammifères et de son orthologue Calypso chez la Drosophile envers H2Aub. Le blocage de la monoubiquitination des ASXLs par des mutations ciblant la lysine K370 induit une inhibition de l’activité de BAP1, ce qui cause une dérégulation du cycle cellulaire chez les cellules mammifères et une transformation homéotique haltère-aile chez la Drosophile. De plus, il nous a été possible de constater l’importance de cette monoubiquitination dans le cancer en démontrant la forte corrélation d’expression de BAP1/ASXL2 et les UBE2Es au niveau du mésotheliome, un cancer connu pour la dérégulation de BAP1.

Nos résultats indiquent l’importance des modifications post-traductionnelles, dont la monoubiquitination, dans la régulation de la fonction et la stabilité du complexe BAP1. De plus, nous décrivons un nouveau mécanisme d’activation d’une deubiquitinase par la monoubiquitination de son cofacteur. D’autres études seront nécessaires afin de comprendre le lien entre l’activation de BAP1/ASXL2 par monoubiquitination et la fonction suppresseur de tumeurs de BAP1 via la deubiquitination d’H2Aub. D’autre part, nous avons fait l’observation que la déplétion de la deubiquitinase associée à la particule régulatrice du protéasome, PSMD14, induit non seulement une réduction drastique d’H2Aub dans la cellule, mais aussi une mort cellulaire rapide. Ceci nous a poussé initialement à investiguer l’implication de l’activité catalytique du protéasome dans la régulation d’H2Aub en lien avec la mort cellulaire. Malgré le fait que nous n’ayons pas trouvé un lien direct entre PSMD14 et la deubiquitination d’H2Aub, nous avons identifié plusieurs candidats (DUBs et E2s) impliqués dans l’induction de la mort cellulaire tout en surmontant une résistance acquise contre des inhibiteurs ciblant l’activité catalytique du protéasome. Ces candidats pourraient représenter des cibles intéressantes pour développer des inhibiteurs spécifiques afin de contrecarrer la résistance aux inhibiteurs du protéasome.

Ubiquitination is a post-translational modification of proteins that involves covalently attaching the ubiquitin moiety to the lysine residues of the target protein. This modification has been reported to have a significant impact on the function, localization and stability of these targets. Once established by enzymes called E3 ligases, ubiquitination can be removed by specific enzymes called deubiquitinases, thus modulating the effects caused by this modification. BAP1 (or BRCA1-Associated Protein1) is a deubiquitinase, from the UCH (Ubiquitin C-terminal Hydrolases) family, that was originally identified as a partner of the BRCA1 (BReast Cancer Associated gene 1) tumor suppressor. We and other research groups have shown that BAP1 is associated with other co-factors forming a multi-protein complex involved in several cellular processes such as gene transcription, chromatin regulation, cell cycle regulation and DNA damage response. The major target of BAP1 is ubiquitinated histone H2A, a histone mark that has been frequently associated with a repressive chromatin conformation. What are the mechanisms regulating the BAP1 complex allowing it to perform its biological functions? Does this involve post-translational modifications affecting BAP1 partners? These questions are still incompletely answered. Thus, the objectives of our studies are to characterize the mechanism and the function of the BAP1 complex by studying the post-translational modifications that could affect its obligate partners including ASXLs.

To address these questions, we studied the post-translational modifications affecting BAP1 and its two mutually exclusive co-factors ASXL1 and ASXL2 (Additional Sex Comb-like 1,2). We demonstrated that ASXL1 and ASXL2 are mono-ubiquitinated only when associated with BAP1. Taking into account that the BAP1/ASXLs complexes are highly conserved during evolution, we also demonstrated that the mono-ubiquitination of ASXLs is important for Drosophila development. Using RNAi and CRISPR/Cas9 gene depletion methods and loss-of-function mutants of BAP1 and ASXL2, we identified the precise site of ASXLs ubiquitination, the enzymes responsible for establishing this mono-ubiquitination as well as its effect on catalytic activity of BAP1. On the other hand, we investigated Drosophila development as well as human cell cycle progression to identify the biological function of ASXLs mono-ubiquitination. Our results indicate that the mono-ubiquitination of ASXL2 on lysine 370 in the presence of BAP1 is a conserved post-translational modification catalyzed directly by the UBE2E family of ubiquitin-conjugating enzymes (UBE2E1, 2, 3 in mammals and UbcD2 in Drosophila). This mono-ubiquitination event stimulates the catalytic activity of BAP1 in mammals and its Drosophila ortholog Calypso towards H2Aub in vivo and in vitro. Blocking the mono-ubiquitination of ASXLs, by mutations targeting lysine K370, induces an inhibition of BAP1 catalytic activity causing a deregulation of human cell cycle progression and a haltere-to-wing homeotic transformation in Drosophila. In addition, we were able to assess the importance of ASXLs mono-ubiquitination in cancer using the mesothelioma tumor model, demonstrating a strong correlation between the expression of BAP1/ASXL2 and UBE2Es.

Our results indicate the importance of post-translational modifications, including mono-ubiquitination, in the regulation of the function and stability of the BAP1 complex. Moreover, we describe a novel mechanism of activation of a deubiquitinase by the mono-ubiquitination of its co-factor. Further studies will be needed to shed more light on the link between BAP1/ASXLs activation by mono-ubiquitination and the tumor suppressor function of BAP1 via H2Aub deubiquitination. On the other hand, we have noticed that the depletion of PSMD14, a deubiquitinase associated with the proteasome regulatory particle, induces not only a drastic reduction of H2Aub in the cell, but also rapid cell death. This prompted us initially to investigate the involvement of the catalytic activity of the proteasome in the regulation of H2Aub in connection with cell death. Although we did not find a direct link between PSMD14 and H2Aub deubiquitination, we identified several candidates (DUBs and E2s) involved in the induction of cell death while overcoming acquired resistance against proteasome catalytic inhibitors. These candidates may represent attractive targets for developing specific inhibitors to counteract resistance to proteasome inhibitors.