Identification des partenaires de gM du virus VHS-1 par BioID couplée à la spectrométrie de masse

Abstract

Parmi les glycoprotéines du VHS-1, la glycoprotéine M (gM) régule la fusion du virus avec la membrane plasmique. gM est la première à être détectée à la membrane nucléaire très tôt dans le cycle viral, 4 h après l’infection. Cependant, le mécanisme par lequel elle est ciblée aux membranes nucléaires, de même que pour les protéines de l’hôte, est encore inconnu. Les partenaires connus de gM trouvés précédemment par double hybride et par co-Immunoprécipitation ne sont pas impliqués dans ce ciblage. L’hypothèse est que d’autres protéines virales, ou cellulaires, y sont impliquées. Afin d’étudier de nouveaux partenaires de gM, une approche par BioID a été utilisée. Des lignées cellulaires exprimant gM couplée à BirA* et d’autres lignées contrôles ont été infectées pendant 4 h ou 12 h avec le virus ∆gM-2 VHS-1. Les échantillons purifiés ont été ensuite analysés par spectrométrie de masse où 177 protéines ont été identifiées. Parmi elles, les protéines SNX1, SNX2, SCAMP3, VPS33B, MTMR6, TMEM43 et XPO6 ont été choisies pour valider leur rôle potentiel par siRNA dans la délocalisation de gM. Leurs effets sur gM sont analysés par immunofluorescence et leurs répressions ont été confirmées par RT-qPCR. Éventuellement, ces cibles seront étudiées pour leur rôle dans la sortie du virus par essai de plaque. Dans le futur, cette étude permettra d’approfondir nos connaissances sur le mécanisme de ciblage à la membrane nucléaire de gM et des protéines cellulaires en proposant un modèle.

Among the glycoproteins of HSV-1, glycoprotein M (gM) regulates the fusion between the envelope of the virus and the plasma membrane. gM is the first one of the viral glycoproteins to be detected in the nuclear membrane early in the viral cycle at 4 h post infection. However, the mechanism by which it’s targeted to the nuclear membrane, as well as for the host’s proteins, is still unknown. The knowns partners of gM that have been previously described by yeast two-hybrid and co-immunoprecipitation do not appear to be involved in this targeting. Herein, we hypothesize that other viral and/or cellular proteins are involved. To investigate the likelihood of new gM partners, a BioID approach was used. Cell lines expressing gM coupled to BirA* and other control cell lines have been used and infected for 4 or 12 h with the ∆gM-2 HSV-1. The purified samples were then analyzed by mass spectrometry where 177 hits were identified. Among them, the proteins SNX1, SNX2, SCAMP3, VPS33B, MTMR6, TMEM43 and XPO6, all implicated in intracellular transport or in the integrity of the intern nuclear membrane, were chosen to validate their putative role in the delocalization of gM by siRNA. The target knockdowns were validated by RT-qPCR and further confirmed using immunofluorescence. Eventually, these targets will be further studied to assess their role in viral egress using plaque assay. In the future, this study will deepen our understanding of the mechanism of viral egress and eventually might provide a new model that could explain how gM and host proteins are being targeted to the nuclear membranes.