Rôle de la CTNNB1 et de ses nouveaux partenaires dans la régulation de l'immunité antivirale innée et de la voie WNT

Abstract

L’immunité innée représente la première ligne de défense de l’organisme contre l’infection virale. La réponse antivirale est initiée par la reconnaissance du pathogène par des récepteurs spécifiques, qui reconnaissent les motifs moléculaires associés aux agents pathogènes, puis initient des voies de signalisation conduisant à l’activation des facteurs de transcription essentiels tels que IRF3 et NF-қB, ce qui entraîne la production des interférons de type I (IFNα et β). Notre laboratoire a réalisé le premier criblage aux ARN interférant à l’échelle génomique, qui a permis l’identification de centaines de nouveaux régulateurs de l’IFNβ en réponse à l’infection par le virus à ARN Sendai (VS). Le criblage ARNi a identifié WNT2B et WNT9B en tant que régulateurs négatifs de la réponse antivirale médiée par les RLRs. Nous avons démontré que WNT2B et WNT9B sont sécrétés suite à l’infection virale et qu'ils régulent négativement l'expression des gènes anti-viraux IFNB1, IFIT1 et TNF. Cette découverte nous a incités à explorer la contribution de la voie de signalisation WNT/CTNNB1 dans la régulation négative de la réponse innée aux virus à ARN. Nous avons démontré que l'infection virale induit l'accumulation d'une forme stabilisée de la CTNNB1 et que le silençage de la CTNNB1 augmente l'expression induite par le VS d’IFNB1, IFIT1 et TNF. Inversement, la stabilisation de la CTNNB1 par des inhibiteurs de GSK3 a entraîné une réduction drastique de la transcription d’IFNB1 et d’IFIT1, mais cette diminution est restaurée dans les cellules déplétées de la CTNNB1. Nous avons également démomtré que la CTNNB1 interagit de manière constitutive avec NF-қB (p65) alors que son interaction avec IRF3 est augmentée suite à l'infection par le VS. Pour mieux élucider le mécanisme d’action de la CTNNB1 dans la régulation de l’immunité antivirale, nous avons utilisé la spectrométrie de masse quantitative pour identifier l'interactome de la CTNNB1 en réponse à l’infection par le VS ou à l'inhibition de GSK3. Nous avons identifié DDB1(DNA Damage-Binding protein 1) comme un partenaire de la CTNNB1 dont l’interaction est réduite en réponse à l’infection par le VS ou à l’activation de la voie WNT/CTNNB1. Nous avons démontré que DDB1 régule négativement l'activité transcriptionnelle de la CTNNB1 en favorisant son ubiquitination et en réduisant sa demi-vie après une stimulation par WNT3A. De plus, nous avons caractérisé DDB1 comme un régulateur négatif de la transcription d’IFNB1. Sur le plan mécanistique, nos résultats préliminaires indiquent que l’ubiquitination de la CTNNB1, qui normalement conduit à sa dégradation par le protéasome, est inhibée suite à l’infection par le VS tandis que le silençage de DDB1 restaure cet effet. Ces résultats suggèrent que DDB1 contribue à une stabilisation de la CTNNB1 dans le contexte de l’infection virale, offrant ainsi un nouveau mécanisme post-transcriptionnel de la régulation négative de l’immunité antivirale innée par la CTNNB1. Nous avons également identifié le répresseur transcriptionnel NKRF (NF-қB repressing factor) en tant qu’interactant de la CTNNB1 qui régule négativement la transcription d’IFNB1 suite à l’infection virale. De plus, le silençage de NKRF et de la CTNNB1 individuellement ou en combinaison augmente la transcription endogène d’IFNB1, d’IFIT1 et de TNF à un niveau similaire suggérant que ces deux protéines fonctionnent par un même mécanisme. Ces données soutiennent fortement le recrutement de complexes protéiques contenant la CTNNB1 et NKRF afin de désactiver la transcription d’IFNB1, TNF et IFIT1 par des mécanismes de répression épigénétiques et/ou transcriptionnels, et de contrôler l’expression excessive des gènes de l’immunité innée suite à l’infection virale. En conclusion, nos résultats ont identifié une nouvelle régulation de l'immunité innée antivirale par la CTNNB1 et ses régulateurs, ouvrant la voie à de nouvelles avenues pour des cibles antivirales à large spectre et à la prévention des maladies liées à l’immunité lors d'une infection virale.

The host innate response to viral infection relies on the presence of pattern recognition receptors (PRR) that specifically recognize pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and then initiate signaling pathways and activate key transcription factors such as IRF3 and NF-қB, which lead to the synthesis of type I interferon (IFN-α/β). In a research program aimed at the discovery of regulators of innate immunity, we performed the first genome-wide silencing screen in response to Sendai virus (SeV) infection. The RNAi screen identified WNT2B and WNT9B as negative regulators of RLR-mediated antiviral response. We next showed that WNT2B and WNT9B are secreted upon viral infection and negatively regulate expression of representative inducible genes IFNB1, IFIT1 and TNF. We further investigated a canonical-like WNT pathway that culminates in CTNNB1 accumulation. Coherently, we found that viral infection induces the accumulation of a stabilized form of CTNNB1 and that CTNNB1 gene silencing increases SeV-induced IFNB1, IFIT1 and TNF expression. Conversely, CTNNB1 stabilization using GSK3 inhibitors resulted in a drastic reduction of virus-induced IFNB1 transcription and IFIT1 expression, but this decrease is restored in CTNNB1 knockdown cells. To uncover mechanistically how CTNNB1 regulated the antiviral immunity, we used quantitative mass-spectrometry to identify CTNNB1 interactome upon SeV infection or GSK3 inhibition. We identified DNA damage-binding protein 1 (DDB1) as an interactor of CTNNB1 that is reduced of CTNNB1 upon SeV or WNT3A stimulations. We showed that DDB1 negatively regulates CTNNB1 transcriptional activity by promoting its ubiquitination and reducing protein half-life following WNT3A stimulation. Strikingly, CTNNB1 ubiquitination is inhibited in SeV-infected cells and restored upon DDB1 depletion, consistent with a distinct role of DDB1 in preventing CTNNB1 degradation and inhibiting the antiviral innate response. We also identified the transcriptional repressor NKRF (NF-қB repressing factor) as a CTNNB1 interactor upon viral infection that negatively regulates IFNB1 production of SeV-infected cells without modulating the canonical pathway with WNT3A. We showed that NKRF KD, CTNNB1 KD and combination increase IFNB1, IFIT1 and TNF transcription to similar fold induction of mRNA levels. The data highly support the recruitment of CTNNB1-NKRF containing protein complexes to turn off IFNB1, TNF and IFIT1 transcription by epigenetic and/or transcriptional repression mechanisms, and control innate immune gene expression after virus recognition signals have resolved. Overall, our findings identify a novel regulation of antiviral innate immunity by CTNNB1 and its regulators, paving the way for novel avenues for broad-spectrum antiviral targets and preventing immune-mediated diseases upon viral infection.