RPA exhaustion as a major cause of genomic instability in polymerase eta-deficient cells

Abstract

Les agents génotoxiques présents dans l’environnement représentent un danger omniprésent pour l’intégrité de l’ADN. Par exemple, les êtres humains sont constamment exposés au rayonnement ultraviolet (UV) solaire, ce qui induit la formation de lésions hautement génotoxiques à l'ADN. Ces lésions bloquent la réplication de l’ADN dans les cellules de la peau et sont la principale cause du développement de tumeurs cutanées. Heureusement, les cellules sont équipées de mécanismes qui atténuent les effets néfastes des UV : i) la réparation par excision de nucléotide (NER) qui permet l'élimination sans erreur des adducts de dipyrimidine induits par les UV (à savoir les photoproduits de 6-4 pyrimidine pyrimidone, 6-4PP et cyclobutane pyrimidine) les dimères; CPD), et ii) la synthèse translésion (TLS) via l'ADN polymérase eta (polη) pour un contournement précis, spécifiquement des CPD. Les mutations germinales dans les gènes de la voie NER conduisent au syndrome autosomique récessif Xeroderma pigmentosum (XP), caractérisé par une sensibilité accrue au soleil et un risque extrêmement élevé de cancer de la peau. D'autre part, l'inactivation germinale de polη est à l'origine du syndrome variant de Xeroderma pigmentosum (XPV), également caractérisé par une sensibilité aux rayons solaires et une incidence élevée de cancers de la peau. En comparaison aux cellules normales, les cellules XPV exposées aux UV présentent i) une hypermutabilité ii) une mort cellulaire accrue iii) un stress de réplication de l'ADN élevé et iv) un NER défectueux exclusivement pendant la phase S. L'objectif principal de cette thèse est de mieux comprendre la base moléculaire de ces phénotypes. Des études récentes ont mis en évidence le rôle du stress réplicatif dans l'épuisement des stocks cellulaires du complexe trimérique RPA (Replication Protein A), ce qui cause subséquemment une augmentation des dommages à l'ADN et des défauts de réparation par NER. Étant donné que la carence en polη entraîne une augmentation du niveau de stress réplicatif dans les cellules exposées aux rayons UV, nous avons

ii émis l’hypothèse que ce stress réplicatif pourrait entraîner une réduction de la disponibilité de RPA et, conséquemment, des niveaux plus élevés d’instabilité génomique. Notre objectif était d'évaluer la dynamique du complexe RPA sur la chromatine post-UV et de vérifier si un excès de RPA pouvait réduire la génotoxicité des UV. Fait intéressant, les cellules dépourvues de pol eta présentent une charge persistante de RPA sur la chromatine, qui est associée à une phosphorylation élevée de l’histone H2AX et à la mort cellulaire. De plus, la surexpression de la RPA dans des cellules XPV atténue la génotoxicité induite par les UV, y compris un défaut de progression du cycle cellulaire, une sensibilité accrue aux UV et la formation de cassures double brin; cependant, la surexpression de RPA n’a aucun effet sur mutagenèse causée par l’absence de pol eta. Nos données indiquent pour la première fois que la disponibilité de la RPA est un facteur déterminant de la réponse cellulaire aux UV dans les cellules déficientes en polη.

Genotoxic agents from the surrounding environment represent an omnipresent danger to the integrity of DNA. For example, humans are constantly exposed to solar ultraviolet (UV) radiation, which induces the formation of highly-genotoxic replication-blocking DNA lesions in skin cells that are the major cause of cutaneous tumor development. Fortunately, cells are equipped with mechanisms that mitigate the deleterious effects of UV, particularly i) nucleotide excision repair (NER) for error-free removal of UV-induced dipyrimidine adducts (i.e. 6-4 pyrimidine pyrimidone photoproducts; 6-4PP and cyclobutane pyrimidine dimers; CPD), and ii) translesion DNA synthesis (TLS) via DNA polymerase eta (polη) for accurate bypass specifically of CPD. Germline mutations in NER pathway genes lead to the autosomal recessive syndrome Xeroderma pigmentosum (XP), characterized by increased sun sensitivity and extremely high risk of developing skin cancer. On the other hand, inactivating germline mutations in polη cause Xeroderma pigmentosum variant (XPV) also characterized by sun sensitivity and high incidence of skin cancer. Upon UV exposure, compared to normal counterparts, XPV cells exhibit i) exquisite hypermutability ii) increased cell death iii) elevated DNA replication stress, and iv) defective NER exclusively during S phase. The major goal of this thesis is to better understand the molecular basis for these deleterious phenotypes. Recent studies have highlighted the role of uncontrolled replication stress in exhaustion of the trimeric replication protein A (RPA) and subsequent increase in DNA damage/repair defects. Since the deficiency of polη leads to increased levels of replication stress in UV-exposed cells, we hypothesized that such replication stress can lead to reduced availability of RPA and subsequent genomic instability. Our aim was to evaluate the dynamics of RPA on chromatin post-UV and to test if a surplus of RPA can rescue UV genotoxicity. Interestingly, cell lacking polη experience persistent RPA loading on chromatin

iv which was associated with elevated H2AX phosphorylation and cell death. In addition, RPA overexpression mitigates the UV-induced genotoxicity including cell cycle progression defect, increased UV sensitivity, and double strand break formation; however, RPA overexpression did not rescue the increased mutagenesis. Our data indicate for the first time that RPA availability is a major determinant of the cellular response to UV in polη-deficient cells.