Mise au point d’un protocole de recellularisation d’une matrice bronchique équine décellularisée

Abstract

Les interactions entre la matrice extracellulaire et le muscle lisse jouent un rôle important dans l’asthme, principalement dans le remodelage bronchique asthmatique. Leur étude in vitro semble donner des résultats souvent non extrapolables in vivo, les modèles monocouches n’étant pas fidèles aux interactions tridimensionnelles se produisant du vivant des patients. Cette étude est une mise au point d’un protocole de décellularisation et de recellularisation d’une bronche équine par des cellules musculaires lisses bronchiques. Elle a pour but l’investigation d’une manière plus fidèle à un environnement in vivo de l’impact d’une matrice extracellulaire bronchique asthmatique sur la variation du phénotype des cellules musculaires lisses bronchiques et réciproquement. Une bonne décellularisation nous permettrait d’obtenir une bronche équine exempte de cellules, mais qui maintiendrait une architecture et une composition matricielle inchangées. L’élimination du matériel cellulaire est nécessaire afin de ne pas confondre les cellules natives du tissu avec les cellules de culture et de ne pas affecter la qualité de la recellularisation. Suite à la décellularisation d’une bronche équine au moyen du protocole Triton / Sodium déoxycholate, nous avons obtenu une bronche acellulaire (échafaud) présentant une très faible quantité d’ADN double brin (moins de 100 pg/100 mg de poids sec) et l’ADN restant était d’un poids moléculaire inférieur à 100 paires de bases. Cet échafaud a maintenu une très bonne architecture et un contenu protéique presque inchangé en collagènes, en fibronectine et en élastine. La recellularisation de cette matrice avec des cellules musculaires lisses bronchiques primaires a donné des résultats exploitables entre 31 et 41 jours de culture. L’évaluation histologique des recellularisations a montré une colonisation spécifique des cellules musculaires lisses bronchiques de la matrice du muscle lisse bronchique. Cette étude montre qu’il est possible de décellulariser une bronche tout en maintenant un contenu protéique et une architecture favorables à sa recellularisation par des cellules musculaires lisses bronchiques. Ceci représente une base valable pour l’étude subséquente de l’effet de la matrice extracellulaire asthmatique sur le phénotype des cellules musculaires lisses bronchiques.

The interactions between the bronchial extracellular matrix and the bronchial smooth muscle contribute to the asthmatic bronchial remodeling. Results from in vitro studies indicate that the in vitro monolayer models do not recapitulate the complex interactions occurring in vivo. Decellularized tissues are natural three-dimensional matrices permitting the investigation of these interactions as closely as possible to the in vivo models. The aim of this study was to develop a protocol for the decellularization and recellularization of an equine bronchus by bronchial smooth muscle cells. Its purpose is to investigate how the asthmatic bronchial extracellular matrix affects the bronchial smooth muscle cells phenotype. A good decellularization is characterized by a respiratory bronchus completely free of cells while the architecture and the matricial composition remain unchanged. The elimination of the cellular material is necessary to not confound the native cells of the tissue with the cells of culture and to not affect the quality of the recellularization. Following the decellularization of an equine respiratory bronchus using Triton / Sodium deoxycholate protocol, we obtained an acellular bronchus (scaffold) presenting very low double-stranded DNA concentrations (less than 100 pg/100 mg dry weight) and the molecular weight of the remnant DNA was less than 100 base pair. This scaffold maintained a very good architecture and the protein content remained almost unchanged. The recellularization of this matrix gave usable results between 31 and 41 days. The histological evaluation of the recellularizations showed a specific colonisation of the muscular extracellular matrix by bronchial smooth muscle cells. This study shows that it is possible to decellularize an equine bronchus while maintaining a protein composition and an architecture favorable to its recellularization by bronchial smooth muscle cells. This represents a valid basis for the subsequent study of the effect of the extracellular asthmatic matrix on the smooth muscle cells phenotype.