Analyse biochimique et inhibition de complexes macromoléculaires dans des cellules humaines et bactériennes

Abstract

Les complexes macromoléculaires sont au cœur des processus fondamentaux de la cellule. L’étude de leur composition, de leur structure et des interactions qui s’exercent entre leurs composants permet de mieux appréhender leurs fonctions ; leurs composants représentant bien souvent des cibles d’intérêt en recherche clinique. Lors de mon doctorat nous avons ainsi mis en place une approche multidisciplinaire afin d’étudier deux complexes macromoléculaires : la machinerie eucaryote de synthèse et d’incorporation des sélénocystéines dans les protéines ; et le système de sécrétion de type 4 d’Helicobacter pylori. La sélénocystéine, 21e acide aminé du code génétique, a pour particularité de ne pas avoir de codon dédié et d’être encodé par le codon « stop » UGA. Ainsi, le décodage en sélénocystéine requiert une machinerie de traduction spécialisée, qui repose sur des interactions transitoires entre protéines et ARN. Bien que les principaux acteurs de la machinerie soient à présent identifiés, de nombreux détails moléculaires restent à clarifier. Afin de caractériser les interactions, de nature dynamique et transitoire, entre les acteurs de la machinerie connus à ce jour, nous avons tiré avantage de l’essai BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer). Ainsi, nos études d’interaction in vivo nous ont permis de définir l’état oligomérique des différents facteurs et d’identifier plusieurs interactions inconnues jusqu’alors. Les sites d’interaction entre plusieurs facteurs de la machinerie ont également été déterminés par des approches in vitro. Nous proposons ainsi un modèle plus détaillé des étapes conduisant au décodage de la Sec. De plus, nous proposons le premier modèle structural d’une protéine clé, mais mal connue, de la machinerie (SECp43), qui pourra par la suite être exploité pour élucider l’implication de la protéine dans la machinerie de traduction. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’étude du système de sécrétion de type 4 d’Helicobacter pylori. La bactérie H. pylori est un pathogène humain dont la présence dans l’organisme accroît le risque de développement de cancer gastrique, le système de sécrétion de type 4, encodé par certaines souches, constituant un facteur aggravant de la pathogénicité. Du fait de l’émergence de souches d’H. pylori multirésistantes aux antibiotiques, les traitements actuels pour éradiquer la bactérie deviennent inadaptés. Ainsi, nous proposons d’adopter une stratégie alternative aux antibiotiques. Nous avons donc entrepris de développer et caractériser des molécules capables d’inhiber la virulence de la bactérie, en ciblant la protéine Cagα, une ATPase du système de sécrétion de type 4. La molécule 1G2 a ainsi été identifiée. Celle-ci inhibe l’activité ATPase de Cagα et diminue de près de 50% la réponse pro-inflammatoire des cellules eucaryotes, induite sous l’effet de l’infection par H. pylori. L’efficacité de la molécule a, par la suite, été évaluée sur des souches cliniques d’H. pylori résistantes aux antibiotiques, préalablement caractérisées. Nous avons ainsi mis en évidence que la molécule 1G2 était également efficace sur des souches cliniques hautement virulentes, de type occidental et d’Asie de l’Est. La chronicité de l’infection par H. pylori pouvant conduire au développement de cancers gastriques, nos résultats suggèrent le fort potentiel de la molécule 1G2 dans le traitement de l’infection. Cette molécule pourra notamment servir de base pour la conception d’autres molécules ayant un effet plus notoire sur la virulence d’H. pylori.

All cellular processes depend on macromolecular complexes. Studying their composition, structure and the interactions between their components is a crucial step toward understanding of their functions. Moreover, their components can be targeted in applied research aimed at drug design. During my Ph.D., we set up a multidisciplinary approach to study two macromolecular complexes: the eukaryotic selenocysteine (Sec) biosynthesis and incorporation machinery and the H. pylori type 4 secretion system. Sec is the 21st amino acid of the genetic code and is encoded by the UGA stop codon. Thus, Sec decoding requires a specialized translation machinery and is driven by transient interactions between RNA and proteins. Although the main factors of the machinery are now identified, many molecular details remain to be clarified. In order to characterize the interactions between all the known factors, we took advantage of the BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) assay. Our in vivo interaction studies allowed us to define the oligomeric state of several factors of the machinery and to identify previously unknown interactions. Sites of interaction between several factors of the machinery were also determined using in vitro approaches. Thus, we propose here a more detailed model of the steps leading to the Sec decoding. In addition, we propose the first structural model of a key protein of the machinery (SECp43), that could be later exploited to elucidate the function of the protein in the translation machinery. Then we focused on the type 4 secretion system of Helicobacter pylori. The H. pylori bacterium is a human pathogen whose presence increases the risk of gastric carcinogenesis. The type 4 secretion system encoded by some strains constitute an aggravating factor of pathogenicity. Due to the emergence of multidrug-resistant H. pylori strains, current treatments to eradicate bacteria become unsuitable. Thus, we propose to adopt an alternative strategy to antibiotics and undertook to develop and characterize molecules capable of inhibiting the virulence of the bacterium. The 1G2 molecule, that targets the Cagα ATPase protein, was identified. The 1G2 molecule inhibits the ATPase activity of Cagα and decreases by almost 50% the proinflammatory response of eukaryotic cells induced by the H. pylori infection. The effectiveness of the molecule was subsequently evaluated on drug-resistant clinical strains of H. pylori, genetically and biochemically characterized. We have demonstrated that the 1G2 molecule was also effective on highly virulent clinical strains. As chronicity of H. pylori infection may lead to the development of gastric cancers, our results suggest the high potential of the 1G2 molecule in the treatment of H. pylori infection. This molecule could serve as a basis for the design of other molecules having a more noticeable effect on the virulence of H. pylori.