Étude de la relation entre structure, dynamique et fonction de l’ARN par l’ingénierie du ribozyme VS de Neurospora

Abstract

L’activité et la fonction des ARN catalytiques sont étroitement liées à leur structure tridimensionnelle et à leur dynamique. Mieux comprendre la nature précise de ce lien permettrait potentiellement d’adapter ces ARN à de nouveaux substrats et modifier leurs caractéristiques cinétiques d’une manière rationnelle. Le ribozyme Varkud Satellite (VS) de Neurospora est un petit ribozyme nucléolytique caractérisé biochimiquement de manière approfondie. Son activité dépend d’une interaction boucle-boucle de type kissing-loop entre la boucle V du ribozyme et la boucle I de son substrat replié en tige-boucle. Ces caractéristiques en font un excellent modèle pour des études portant sur le lien entre structure, dynamique et activité des ARN catalytiques à des fins d’ingénierie. Bien que notre compréhension de la structure du ribozyme VS se soit largement améliorée depuis le début de mes travaux de thèse, elle reste essentiellement d’une nature statique. Il est ainsi important d’une part d’approfondir les connaissances relatives au potentiel d’ingénierie du ribozymes VS et d’autre part de brosser un portrait dynamique de sa fonction de clivage dans le but de procéder à son ingénierie rationnelle. Dans cette optique, il a été entrepris de démontrer en premier lieu que le ribozyme VS était capable de reconnaitre et cliver des substrats de longueur différentes mais également qu’il était possible de modifier la longueur de l’hélice V afin de cliver des substrats trop courts ou trop longs pour être clivés par le ribozyme naturel. Une fois cette démonstration faite, la possibilité de substituer l’interaction de type kissing-loop I/V, sous-domaine crucial pour la reconnaissance du substrat, par des interactions de même type et structuralement similaires a été confirmée. Finalement, les données cinétiques récoltées sur des ribozymes incorporant soit ces variantes, soit l’interaction naturelle ont été comparées aux capacités dynamiques intrinsèques de ces interactions kissing-loop, évaluées en dynamique moléculaire, afin de relier leur structure, leur dynamique et leur activité. Ces travaux auront permis de mieux comprendre dans quelle mesure et de quelle façon le ribozyme VS pouvait être modifié pour être adapté à de nouveaux substrat. Mais plus généralement, ils nous ont offert une compréhension accrue des paramètres structuraux et dynamiques important à considérer afin de procéder à l’ingénierie rationnelle d’un ARN fonctionnel.

The activity and function of catalytic RNAs are closely related to their three-dimensional structure and dynamics. Better understanding the precise nature of this link would potentially allow to adapt these RNAs to cleave new substrates and modify their kinetic characteristics in a rational way. Neurospora Varkud Satellite (VS) ribozyme is a small nucleolytic ribozyme that has been very well characterized biochemically. Its activity depends on a kissing-loop interaction between loop V of the ribozyme and loop I of its substrate folded into a stem-loop. These features make it an excellent model for studying the link between structure, dynamics, and activity of catalytic RNAs for engineering purposes. Although our understanding of the structure of the VS ribozyme has greatly improved since the beginning of my PhD., it remains essentially a static depiction. It is therefore important to know more about the engineering potential of the VS ribozyme and to draw a dynamic portrait of its cleavage function, in order to proceed to its rational engineering. From this perspective, efforts were made to demonstrate that the VS ribozyme could recognize and cleave substrates of different lengths and furthermore that it was possible to modify the length of helix V to cleave substrates that were too short or too long to be cleaved by the natural ribozyme. The possibility of substituting the I/V kissing-loop interaction, a subdomain crucial for the recognition of its substrate, for structurally similar interactions of the same type was then confirmed. Finally, the kinetic data collected on ribozymes containing either these variants or the natural interaction were compared to the intrinsic dynamics of the kissing-loop interactions, evaluated in molecular dynamics, in order to link their structure, dynamics and activity. This work helped us better understand to what extent and how the VS ribozyme could be modified to be adapted to new substrates. More generally, it gave us an increased understanding of the important structural and dynamic parameters to take into account in order to rationally engineer a functional RNA.