Caractérisation des rôles de l"Anilline durant la cytokinèse

Abstract

La cytokinèse est un processus conservé par lequel une cellule se sépare physiquement en deux. Le fuseau mitotique fournit les signaux au niveau du cortex afin de positionner le sillon de clivage. Ensuite, un anneau contractile riche en acto-myosine (AC) est assemblé et va permettre la fermeture de la cellule à son équateur. Au fur et à mesure que l’AC se contracte, la zone médiane du fuseau mitotique va se compacter pour former le midbody (MB) et un anneau du midbody (AM) se forme pour stabiliser le pont intercellulaire jusqu'à l'abscission. Des défauts à l'une de ces étapes peuvent provoquer un échec de la cytokinèse et générer des cellules tétraploïdes binucléées, souvent observées dans des conditions pathologiques telles que le cancer. Des criblages génétiques et biochimiques ont identifié les protéines clés conservées qui constituent la machineriede la cytokinèse, cependant, on ignore comment la fermeture de l’AC est couplée à la formation du midbody et de l’AM; ni comment l'ancrage de la membrane plasmique est maintenu durant ces événements de transition clés. L'Anilline est une composante essentielle de cette machinerie qui échaffaude de nombreuses protéines telles que l'actine, la myosine et les septines, mais on ignore comment l’Anilline agit avec ses nombreux partenaires dans le temps et l'espace pour guider la cytocinèse. Afin d’adresser ces questions, nous avons effectué une analyse de structure/fonction de l'Anilline par microscopie en temps réel de cellules S2 de Drosophila. L'Anilline se localise à l’AC et l’AM et sa déplétion n'affecte pas l'assemblage de l’AC, mais bloque plutôt la cytokinèse à un stade plus tardif. Nous avons trouvé que l’Anilline est nécessaire pour la stabilité de l’AC et la formation de l’AM. L'analyse de mutants tronqués a révélé que l’extrémité N-terminale de l'Anilline se lie à l’AC et supporte la formation de structures stables semblables à l’AM, mais celles-ci ne pouvaient pas maintenir l'ancrage de la membrane plasmique. Inversement, l’extrémité C-terminale ne localise ni à l’AC ni à l’AM, mais recrute la septine Peanut à des structures ectopiques au niveau du cortex équatorial et régit l’ancrage de l’AM à la membrane plasmique. Ensuite, nous avons entrepris de caractériser cette transition plus en profondeur et nous montrons que la transition de l’AM à l’AC passe par un processus de maturation non caractérisé auparavant, qui nécessite des mécanismes opposés de rétention vs élimination de l'Anilline à l'équateur. La kinase Citron/Sticky agit sur l’extrémité N-terminale de l'Anilline pour la retenir à l’AM mature, alors que les septines agissent sur l’extrémité C-terminale de l'Anilline pour éliminer localement l'excès de membrane de l’AM naissant par internalisation, extrusion et excrétion de la membrane plasmique et des protéines qui y sont associées. Finalement, notre analyse structure/fonction de l'Anilline a également révélé son rôle durant la maturation du MB via son extrémité C-terminale qui régit le recrutement des septines et se lie à Tumbleweed / RacGAP50C (Tum). Tum est une protéine activatrice de la GTPase (GAP) requise au début de la cytocinèse pour la formation du fuseau central et l'initiation du sillon, puis pour l'ancrage du MB à la membrane plasmique. Cependant, il n'y a pas de consensus sur le rôle de son activité GAP et aucune fonction connue pour son interaction avec l’Anilline. Notre étude de structure/fonction par microscopie en temps réel de Tum a révélé que l'activité GAP de Tum et son domaine central sont requis pour la formation et la fermeture de l’AC. De plus, nous montrons que sa région de liaison à l'Anilline contribue au recrutement cortical de Tum et à la maturation MB / MR d'une manière dépendante de l'Anilline. Enfin, nous dévoilons une interaction génétique entre Tum et l’Anilline qui intervient dans l'initiation du sillon. Ces résultats suggèrent que l'interaction entre l’Anilline et Tum relie la transition de l’AC en AM à la maturation du fuseau central en MB tout au long de la cytokinèse. Ensemble, les résultats présentés dans cette thèse montrent qu’à travers ses multiples interactions l’Anilline est une protéine clé impliquée tout au long de la cytokinèse de l’initiation du sillon à la formation de l’AC, sa stabilisation et sa maturation en AM ainsi que son ancrage à la memebrane plasmique. Mots clés: Anilline, cytokinèse, Anneau contractile, Anneau du midbody, Midbody, Tum, Tumbleweed/ RacGAP50C, septines, Peanut, Citron Kinase, Sticky, pont intercellulaire.

Cytokinesis is a multi-step conserved process by which a cell physically separates into two. First, signalling between the mitotic spindle and the cortex provides cues to position the cleavage furrow. Then, an acto-myosin contractile ring (CR) is assembled and will constrict the cell at its equator. As the CR constricts the mitotic spindle’s midzone will mature to form the midbody (MB) and a stable midbody ring (MR) forms to stabilize the intercellular bridge until abscission. Defects at any of these steps can cause cytokinesis failure and generate binucleate polyploid cells, often observed in pathological conditions such as cancer. Genetic and biochemical screens have identified the key, conserved proteins that constitute the cytokinetic machinery, however, it remains unclear how CR closure is coupled to MB and MR formation and how plasma membrane anchoring is maintained at this key transition events. Anillin is a core and essential component that scaffolds many other cytokinesis proteins such as actin, myosin and septins, but it remains unclear how Anillin acts with its numerous partners in time and space to guide progress through cytokinesis. To address these questions we performed a structure-function analysis of Anillin by time‐lapse microscopy in Drosophila S2 cells. Anillin localizes to the CR and the MR and its depletion does not affect CR assembly, but rather blocks cytokinesis at a mid‐late furrowing stage. We have found that Anillin is required for the stability of the CR, formation of the MR and the maturation of the MB. Truncation analysis revealed that Anillin N-terminus connected with the actomyosin CR and supported formation of stable MR-like structures, but these could not maintain anchoring of the plasma membrane. Conversely, Anillin C-terminus failed to connect with the CR or MR but recruited the septin Peanut to the equatorial cortex and together mediated anchorage of the MR to the membrane. Next, we further characterized this CR to MR transition and show that it proceeds via a previously uncharacterized maturation process that requires opposing mechanisms of removal and retention of Anillin at the equator. The Citron kinase Sticky acts on the N-terminus of Anillin to retain it at the mature MR, whereas the septin cytoskeleton acts on the C-terminus of Anillin to locally trim away excess membrane from the nascent MR via internalization,extrusion, and shedding of the plasma membrane and associated proteins. Our structure function analysis of Anillin also revealed a requirement for Anillin in MB maturation via its C-terminus that mediates the recruitment of septins and binds to the microtubule associated protein Tumbleweed/RacGAP50C (Tum). Tum is a GTPase activating protein (GAP) required early during cytokinesis for central spindle formation and furrow initiation and later for anchorage of the MB to the plasma membrane. However, there is no consensus on the role of its GAP activity and no known functions for its interaction with Anillin. Our structure function study by real-time microscopy of Tum revealed that the GAP activity of Tum and its central domain are required for CR formation and closure. Furthermore, we found that the putative Anillin binding region of Tum contributes to Tum cortical recruitment and MB/MR maturation later during cytokinesis in an Anillin-dependant manner. Finally, we unveil a genetic interaction between Tum and Anillin that mediates furrow initiation. These results suggest that the interaction between Anillin and Tum links the CR\MR to the spindle/MB throughout cytokinesis. Together, the results presented in this thesis show that through its multiple interactions Anillin is a key protein involved throughout cytokinesis from initiation of the cleavage furrow to the formation of the CR, its stabilization and maturation to a MR as well as its anchoring to the plasma membrane. Key words: Anillin, cytokinesis, Contractile ring, Midbody ring, Midbody, Tum, Tumbleweed / RacGAP50C, septin, Peanut, Citron Kinase, Sticky, Intercellular bridge.