Identification de nouveaux substrats de la voie Ras-MAP Kinase

Abstract

ERK1 et ERK2 (ERK1/2) sont des kinases membres de la voie de signalisation Ras-MAP Kinase impliquées dans la régulation de la croissance, de la division ainsi que de la différenciation des cellules. Bien que le rôle crucial de la voie MAP Kinase dans ces fonctions soit bien documenté, les mécanismes à son origine le sont moins. Ainsi, de nombreux effecteurs en aval de ces kinases continuent à ce jour d’être identifiés et caractérisés. Dans un effort pour identifier de nouveaux substrats des kinases ERK1/2, deux études phosphoprotéomiques à grande échelle furent effectuées par notre laboratoire et ont permis d’identifier plus d’une centaine de nouveaux substrats potentiels. Parmi ceux-ci se retrouvent notamment des régulateurs de l’épissage alternatif de l’ARN messager. Les mécanismes de régulation de ce processus par les voies de signalisation ne sont cependant toujours pas bien caractérisés.

La première étude de cette thèse s’intéresse ainsi à la validation de ces nouveaux substrats de ERK1/2. Nous avons notamment identifié et validé les régulateurs de l’épissage CDK12, RNPS1, MBNL2 et SRPK2 comme de nouveaux substrats de ERK1/2 par essai kinase in vitro. En regard au rôle potentiel qu’une régulation de ces substrats par la voie MAP Kinase pourrait avoir, nous avons étudié les étapes précoces de la différenciation telle qu’entraînée par l’expression de la kinase ERK1 dans un modèle de cellules souches embryonnaires murines déficientes en ERK1/2. Nous avons identifié une soixantaine de transcrits épissés de manière différentielle suivant l’expression de ERK1, dont notamment ceux de DNMT3b et de la delta-caténine. Nous avons ainsi observé une diminution de l’épissage du transcrit de DNMT3b en réponse à l’activité ERK1, menant à une augmentation de l’expression de l’enzyme avec l’exon encodant le domaine catalytique.

La dernière étude de cette thèse porte finalement sur l’identification de la beta-caténine comme nouveau substrat de MEK1/2. Nos expériences suggèrent que cette phosphorylation survient de manière prédominante sur la thréonine 472 et que ce site a un rôle important dans la stabilité de la protéine.

Ainsi, cette thèse édifie, d’une part, les bases d’une régulation à grande échelle de l’épissage alternatif par les MAP Kinases ERK1/2, et d’autre part révèle un nouvel élément de régulation entre la voie Wnt/beta-caténine et la voie MAP Kinase par l’identification de la beta-caténine comme nouveau substrat de MEK1/2.

ERK1 and ERK2 (ERK1/2) are members of the Ras-dependent MAP Kinase pathway involved in the regulation of cell proliferation, differentiation and survival. While the roles of these MAP Kinases in the control of these functions are now well documented, the mechanisms behind them are often poorly described. Therefore, many effectors downstream of these kinases are still being identified and characterized. To identify new substrates of the ERK1/2 kinases, two large-scale phosphoproteomic studies were performed by our laboratory and allowed us to identify over a hundred new putative substrates. Among these are some alternative splicing regulators. The mechanisms governing the regulation of this process by upstream signaling pathways aren’t quite well understood yet.

The first study within this thesis focuses on the validation of these new substrates of ERK1/2. Namely, we identified and validated that the splicing factors CDK12, RNPS1, MBNL2 and SRPK2 are novel substrates of ERK1/2 by in vitro kinase assay. Regarding the potential role that a regulation of these factors by the MAP Kinase pathway might have, we studied the early stages of differentiation as driven by the expression of the ERK1 kinase in a ERK1/2 DKO embryonic stem cells murine model. We identified 60 alternatively spliced transcripts following ERK1 expression, including those from DNMT3b and delta-catenin expression. We notably observed a decrease in the splicing of the DNMT3b transcript in response to ERK1 activity, leading to an increase in the expression of the enzyme with the exon coding the catalytic domain.

The last part of this thesis revolves around the identification and characterization of beta-catenin as a novel substrate of MEK1/2. Our research suggest that this phosphorylation occurs predominantly on threonine 472 and that this site is important in maintaining the stability of the protein.

This thesis lays the ground work for a global understanding on how the MAP Kinases ERK1/2 regulates alternative splicing on one hand, and also defines a novel element of regulation between the Wnt/beta-catenin and the MAP Kinase pathway by identifying beta-catenin as a new substrate of MEK1/2.