Caractérisation de l'oxydoréduction de la protéine tyrosine phosphatase 1B dans la signalisation du récepteur à l'EGF

Abstract

Les ROS (reactive oxygen species) inactivent les protéines tyrosines phosphatases (PTPs) en oxydant leur cystéine catalytique, ce qui cause d’importants changements conformationnels. Afin de caractériser la régulation rédox de la protéine tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), nous avons modélisé la structure tridimensionnelle de ses formes oxydée et réduite et nous avons identifié un peptide dérivé de sa boucle de liaison aux phosphotyrosines (BLP) nouvellement exposé au cytosol dans sa forme oxydée. Dans le but d’identifier de nouveaux partenaires d’interaction de PTP1B oxydé, nous avons utilisé ce peptide BLP, effectué des pull-downs, puis avons purifié et identifié la protéine 14-3-3z. Nous avons stimulé des cellules avec le facteur de croissance épidermique (EGF) afin de caractériser par co-immunoprécipitation l’interaction entre PTP1B oxydé et 14-3-3z. Nos résultats indiquent que cette interaction était dépendante des ROS intracellulaires et de la phosphorylation de PTP1B par la protéine kinase B (PKB). La liaison de 14-3-3z était par ailleurs déstabilisée par le R18, un inhibiteur des 14-3-3, et la triciribine, un inhibiteur de PKB. De plus, plusieurs peptides BLP pénétrants bloquaient l’interaction entre PTP1B oxydé et 14-3-3z et favorisaient la réduction et la réactivation de PTP1B. Nos résultats suggèrent que l’interaction entre la protéine 14-3-3z et PTP1B est nécessaire afin de stabiliser la forme oxydée de la phosphatase. Étant donné le rôle important des PTPs dans plusieurs pathologies humaines, le développement de peptides activateurs de PTPs constitue une avancée importante.

Reactive oxygen species (ROS) inactivate protein tyrosine phosphatases (PTPs) by oxidizing their catalytic cysteine, initiating important conformational changes. To characterize the redox regulation of protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), we modeled the tridimensional structure of its oxidized and reduced forms and we detected a newly exposed peptide derived from its phosphotyrosine binding loop (BLP) in its oxidized form. To find new proteins interacting with the oxidized form of PTP1B, we used this BLP peptide in pull-down assays and identified the 14-3-3z protein as a BLP-interacting protein. We stimulated cells with the epidermal growth factor (EGF) to characterize the interaction between oxidized PTP1B and 14-3-3z with co-immunoprecipitations. As expected, our results indicate that this interaction depends on intracellular ROS production. In addition, 14-3-3z interaction was prevented by preincubating cells with R18, a 14-3-3 inhibitor, or by triciribine, a PKB inhibitor, prior to EGF stimulation. Furthermore, several cell-penetrating BLP peptides prevented the interaction between oxidized PTP1B and 14-3-3z and promoted its reduction and reactivation. Our results suggest that the interaction between 14-3-3z and PTP1B is essential to stabilize the oxidized form of the phosphatase. Given the important role of PTPs in many human diseases, the development of PTP activating peptides represents a significant progress.