Étude de la perméabilité intestinale des médicaments par la reconstitution du transporteur BCRP/ABCG2 dans des protéoliposomes

Abstract

La perméabilité membranaire des cellules régule l’absorption et la distribution des médicaments dans le corps. Des modèles in vitro comme le test cellulaire Caco-2 et le test non cellulaire PAMPA sont utilisés pour prédire la biodisponibilité des médicaments. Cependant, le premier est limité par sa reproductibilité et l’hétérogénéité des conditions de culture et le second ne permet que d’étudier le transport passif. Par ailleurs, aucun modèle ne permet l’analyse d’un transporteur membranaire spécifique de façon isolée. Il est proposé d’étudier la perméabilité membranaire en utilisant une nouvelle approche basée sur l’incorporation de transporteurs recombinants dans des liposomes. Le transporteur choisi pour ce projet est la protéine humaine ABCG2/BCRP qui a le potentiel de limiter la biodisponibilité orale des médicaments. BCRP a été exprimé dans la levure Pichia pastoris et a été purifié par chromatographie d’affinité. L’isoforme 1 de BCRP a été modifié par PCR et cloné dans le vecteur d’expression pJ902-15. Le plasmide résultant contient la région codante pour BCRP avec une étiquette de 10 histidines sous le contrôle du promoteur AOX1. La transformation dans P. pastoris est effectuée par électroporation avec le vecteur pJ902-ABCG2i-His10 linéarisé. Le clone possédant le plus haut niveau d’expression de BCRP a été déterminé par immunobuvardage à l’aide de l’anticorps monoclonal BXP-21. Ce clone a été inoculé dans 1 L de milieu MGY puis les cellules ont été induites dans le milieu MM contenant du méthanol. Les cellules ont été lysées à l’aide du Freezer/Mill et les microsomes ont été solubilisés et purifiés sur une colonne HisTrap HP par le système ÄKTA-FPLC. Un système d’expression a été établi pour la production de l’isoforme 1 de BCRP recombinant chez P. pastoris. L’immunobuvardage montre que BCRP-His10 a un poids apparent de 65 kDa. À partir d’une culture de levures de 1 L, environ 125 mg de BCRP a pu être partiellement purifié. La prochaine étape pour cette partie du projet est de confirmer que BCRP-His10 est fonctionnel en mesurant son activité ATPase en présence de la prasozine. Les protéoliposomes de BCRP recombinant serviront de preuve-de-concept pour la génération d’une librairie de transporteurs recombinants incorporé dans des liposomes. Ce modèle facilitera la compréhension des mécanismes structuraux et fonctionnels du transport des médicaments dans les cellules.

Intestinal membrane transporters play a critical role in the pharmacokinetics of orally administered drugs. Membrane permeability of cells regulate the absorption of drugs by modulating their distribution in the body. In vitro models like the Caco-2 cell-based assay and the non-cellular PAMPA assay are used to predict the bioavailability of drugs. However, the Caco-2 assay is limited by its reproducibility and heterogeneity of the culture conditions while the PAMPA assay is only used to observe passive permeability. Thus, no model allows the study of isolated and specific membrane transporters. We propose to study membrane permeability with a new approach using a non-cellular lipid bilayer constituted of recombinant transporter. In this study, the isoform 1 of the human BCRP/ABCG2, which is known to limit the intestinal absorption of drug substrates, was expressed in the yeast Pichia pastoris and purified by affinity chromatography. The isoform 1 of BCRP cDNA was modified by PCR and cloned into the expression vector pJ902-15. The resulting construct contain the coding region of BCRP with a 10 histidines tag under the control of the AOX1 promoter. P. pastoris transformation was carried by electroporation with the linearized vector pJ902-ABCG2i-His10. The clone with the highest BCRP expression was determined immunoblotting using mAb BXP-21. This clone was inoculated in 1 L of MGY media and induced in the MM media containing methanol. The cells were lysed using a Freezer/Mill and the microsomes were solubilized and purified on an ÄKTA-FPLC system using a HisTrap HP column. We have established a P. pastoris expression system for the production of the recombinant transporter BCRP. Immunoblotting of whole cell lysates shows that the recombinant BCRP has an apparent weight of 65 kDa. From a 1 L yeast culture, approximately 125 mg of BCRP was partially purified. To confirm that BCRP-His10 is functional, further studies are necessary by measuring the ATPase activity in presence of prazosin. The proteoliposomes of the recombinant BCRP will serve as a proof-of-concept for the generation of a library of recombinant transporter proteins incorporated into liposomes. This model will facilitate the assessment and understanding of the bioavailability of drug candidates.