Le rôle de l'autophagie et de la sénescence dans la fibrose induit par la radiothérapie : implications cliniques en reconstruction mammaire prothétique

Abstract

La fibrose péri-prothétique est la complication la plus fréquente de la reconstruction mammaire par implant et se manifeste cliniquement par une contracture capsulaire. Cette complication est d'autant plus fréquente et sévère chez les patientes ayant nécessité un traitement de radiothérapie. Les indications de la radiothérapie adjuvante post-mastectomie sont de plus en plus élargies qu'auparavant. Dans un contexte où un nombre croissant de patientes auront recours à la radiothérapie dans le plan de traitement oncologique, la plupart des guides de pratique suggère de retarder la reconstruction mammaire jusqu'après la radiothérapie afin de prévenir les complications fibrotiques à long-terme. Est-ce que la radiothérapie modifie les propriétés cellulaires de façon permanente affectant ainsi les résultats cliniques de la reconstruction mammaire prothétique ? Si oui, y a-t-il un avantage à retarder la reconstruction mammaire post radiothérapie ? Notre modèle in vitro simulait deux approches de reconstruction mammaire par prothèse où la radiothérapie est nécessaire : l'irradiation de la reconstruction mammaire et la reconstruction mammaire prothétique retardée suite à la radiothérapie. Nous avons procédé à la culture cellulaire de fibroblastes pulmonaires Wi38 et des cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC). Les fibroblastes irradiés simulaient les tissus sains retrouvés autour de l'implant. L'irradiation retardée de la reconstruction mammaire prothétique était simulée par des fibroblastes non-irradiés conditionnés dans un surnageant obtenu de cellules endothéliales irradiées. L'autophagie était induit par la culture cellulaire en milieu sans sérum. L'activation de la sénescence était déterminée grâce à des marqueurs protéiques connus tel que p16 par dosage Western Blot et le marquage histologique à la β-Galactosidase. La diminution du taux protéique de p62 était utilisée comme marqueur d'autophagie. Le Connective Tissue Growth Factor (CTGF), un activateur de la différentiation myofibroblastique, était dosé dans les lignées Wi38 et HUVEC. Le marqueur protéique de la différentiation myofibroblastique employé était l'αSMA. La Tubuline-A était utilisée comme contrôle positif des Western Blot. L'irradiation a induit la fibrose par la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes démontrée par une augmentation des taux du αSMA. Ceci constitue la base de la contraction cicatricielle observée dans la reconstruction mammaire par implant lorsque la radiothérapie est indiquée. L'irradiation des cellules endothéliales a induit la sénescence qui est un arrêt irréversible du cycle cellulaire ; de plus, la sécrétion de l'agent profibrotique CTGF a été observé. Les fibroblastes non-irradiés conditionnés avec un surnageant obtenu de cellules endothéliales irradiées ont démontré une différentiation myofibroblastique en plus de l'expression du phénotype fibrotique caractéristique de la contracture capsulaire. Nous n'avons pas observé d'activation autophagique en réponse à l'irradiation dans notre système. Nos résultats démontrent que la radiothérapie cause un arrêt irréversible du cycle cellulaire. Ceci altère le microenvironnement cellulaire en faveur de la fibrose. Étant donné que ces changements sont permanents, retarder la reconstruction mammaire après la radiothérapie ne présente pas d'avantage dans la prévention de la contracture capsulaire.

The most common complication of irradiated implant-based mammary reconstruction is fibrosis and capsular contracture. The indications for post mastectomy adjuvant radiotherapy have significantly broadened. Facing an increased number of patients who will require radiotherapy, most guidelines recommend delaying reconstruction after radiotherapy to prevent long-term fibrotic complications. Does radiotherapy permanently alter cellular properties which will adversely affect implant-based reconstruction? If so, is there a benefit in delaying reconstruction after radiotherapy? Our in-vitro model simulates two implant-based mammary reconstruction approaches: the irradiated implant and the delayed implant reconstruction beneath healthy un-irradiated tissue post radiotherapy. We performed cell culture of fibroblasts and endothelial cells, in an attempt to simulate these two surgical conditions. Irradiated fibroblasts simulate the capsular tissue seen around the breast-implant. The delayed reconstruction approach is simulated by nonirradiated fibroblasts conditioned with supernatant culture media obtained from irradiated endothelial cells. Autophagy was induced by serum starvation. Senescence activation was measured through the protein marker p16 by Western Blot and histological β-Galactosidase staining. The decrease in p62 protein marker levels was used as a marker for autophagy activation. Connective Tissue Growth Factor (CTGF), a potent fibrotic activator, was measured in Wi38 and HUVEC cell lines. The protein marker for myofibroblast différentiation used is αSMA. Tubuline-A was used as a loading control for Western Blots. Irradiation induced fibrosis through fibroblast differentiation into myofibroblasts, as demonstrated by increased α-smooth-muscle actin (αSMA) levels in fibroblasts. This constitutes iv the basis for scar tissue contraction observed in irradiated implant-based breast reconstruction. Irradiation of endothelial cells induced irreversible cell cycle arrest known as senescence and secretion of the pro-fibrotic connective tissue growth factor. Non-irradiated fibroblasts conditioned with culture media obtained from irradiated endothelial cells exhibited myofibroblast differentiation and expression of fibrotic phenotype akin to capsular contracture. We did not observe autophagy activation secondary to irradiation in our system. Our results demonstrate that radiotherapy causes irreversible cellular changes which permanently alter the microenvironment in favor of fibrosis. Given that these changes are permanent, delaying reconstruction does not present an advantage in preventing capsular contracture.