Reassembly and biochemical characterization of the human Smc5/6 complex

Abstract

Les membres de la famille de protéines de maintenance structurelle des chromosomes (SMC) sont des régulateurs essentiels de la stabilité génomique. Le complexe Smc5-6 est indispensable pour la réparation de l'ADN, la maintenance des télomères et le redémarrage des fourches de réplication bloquées. La façon dont le complexe Smc5-6 remplit ses fonctions pour favoriser la stabilité du génome est encore incertaine. Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie de purification pour isoler un complexe réassemblé fonctionnel. Cette approche nous a permis d'effectuer d'importantes analyses biochimiques et structurelles du complexe humain Smc5-6. Nous montrons que le complexe humain se lie avec une affinité plus faible aux substrats ADNdb par rapport à ADNsb. Ce complexe a également été caractérisé par une séparation zonale en gradient continu pour déterminer la masse moléculaire du complexe heteropentamerique après filtration sur gel. Nous avons utilisé la méthode "Gradient Fixation" (GraFix) pour stabiliser le complexe Smc5/6 afin de visualiser celui-ci par microscopie électronique (EM). En conclusion, nous avons identifié avec succès les conditions natives pour la purification d'un complexe Smc5-6 humain entièrement assemblé et fonctionnel. En outre, nous avons montré que ce complexe est biochimiquement actif et lie le ADNsb et le ADNdb avec différentes affinités. L'achèvement de notre analyse structurale éclairera le mécanisme d'action du complexe Smc5-6 lors de la réparation de l'ADN.

Members of the structural maintenance of chromosomes (SMC) family of proteins are essential regulators of genomic stability. The Smc5-6 complex is indispensable for DNA repair, telomere maintenance and restart of stalled replication forks. How the Smc5-6 complex performs its functions to promote genome stability is still unclear. Here, we developed a novel purification strategy to isolate a reassembled complex. This approach allowed us to perform extensive biochemical and structural analyses of the human Smc5-6 complex. We show that the human complex binds with lower affinity to dsDNA substrates relative to ssDNA. This complex was also characterized by rate-zonal centrifugation to determine the molecular mass of the heteropentameric complex after gel filtration. We took advantage of the “Gradient Fixation” (GraFix) method to stabilize macromolecular complexes for single particle electron microscopy (EM). In conclusion, we have successfully identified native conditions for the purification of a fully assembled and functional human Smc5-6 complex. In addition, we showed that this complex is biochemically active and binds ssDNA and dsDNA with different affinities. Completion of our structural analysis will shed light on the mechanism of action of the Smc5-6 complex during DNA repair.