Études des mécanismes d’adaptation du métabolisme énergétique dans le syndrome de Leigh de type canadien français : vers l’identification des cibles thérapeutiques

Abstract

Le syndrome de Leigh de type canadien français (LSFC) est une maladie mitochondriale infantile causée par des mutations dans le gène LRPPRC entraînant une diminution tissu-spécifique de la cytochrome c oxydase (COX) et des crises d’acidose lactique fatales qui surviennent lors d’un stress énergétique. Malheureusement, les facteurs sous-jacents à l’apparition de ces crises demeurent inconnus. Ainsi, l’objectif principal de cette étude est de mieux comprendre la physiopathologie du LSFC en investiguant les mécanismes d’adaptation du métabolisme énergétique. Nous avons précédemment démontré que la déficience en COX dans les fibroblastes de patients LSFC était, d’une part, associée à une altération de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) alors que ces cellules exhibent des taux d’ATP inchangés. D’autre part, ces cellules LSFC sont plus susceptibles à la mort lorsqu’incubées avec une combinaison de 10 mM de lactate et de 1 mM de palmitate (LP), un modèle de surcharge en nutriments mimant les crises chez les patients. Nous avons alors émis l'hypothèse que, premièrement, les cellules LSFC arboreraient une reprogrammation métabolique sous le contrôle du complexe 1 de la « mamalian Target Of Rapamycin » ou mTORC1, permettant une synthèse extra mitochondriale d’ATP. Deuxièmement, un défaut d’activation du senseur énergétique, la protéine kinase activée par l’AMP ou AMPK, contribuerait à la plus grande susceptibilité des cellules LSFC au LP. Nos résultats montrent qu’en conditions basales la voie Akt/mTORC1/p70-S6K est surexprimée dans les cellules LSFC par rapport aux cellules témoins. Ceci est associé à une augmentation de l’expression du facteur inductible par l’hypoxie (HIF-1α) et de sa cible la pyruvate déshydrogénase kinase 1 (PDHK1), un inhibiteur de l'oxydation mitochondriale des glucides via la PDH1 qui est d’ailleurs inhibée dans les cellules LSFC. En accord avec ces observations, nos résultats métabolomiques montrent que la contribution du glucose à la formation du pyruvate, de l’alanine et du lactate est élevée dans les cellules LSFC comparativement aux cellules témoins. De manière inattendue, l’inhibition de mTORC1 par la rapamycine n’a aucun effet significatif sur l’expression de HIF-1α et de PDHK1, ni sur les taux d’ATP dans les cellules LSFC. Par contre, la rapamycine augmente l’inhibition de PDH1 et réduit l’expression de LRPPRC et de COX dans ces cellules LSFC. Ces données soutiennent pour la première fois une possible régulation de LRPPRC par mTORC1. Nous avons également étudié la voie AMPK en réponse à différents stress. L’AMPK est activable en réponse au 2,4-dinitrophénol aussi bien dans les cellules témoins que les cellules LSFC. Le stress nutritionnel LP ne diminue pas les niveaux d’ATP; mais induit la phosphorylation de l’AMPK, la surexpression de SIRT1, COXIV et LRPPRC dans les cellules témoins. Un prétraitement au ZMP, un analogue de l’AMP et activateur de l’AMPK, augmente encore plus les effets observés avec le LP. Tous ces changements en réponse au LP sont abolis dans les cellules LSFC. De façon intéressante, le traitement de nos cellules avec le 2-bromopalmitate, un analogue non métabolisable du palmitate, n’induit pas la phosphorylation de l’AMPK même dans les cellules témoins. Ces résultats suggèrent que le métabolisme du palmitate est requis pour l’activation de l’AMPK et que celui-ci est altéré dans les cellules LSFC. En conclusion, les cellules LSFC présentent une reprogrammation métabolique de type effet Warburg. mTORC1 ne joue pas de rôle clé dans le maintien de niveaux d’ATP, mais son activation est primordiale pour l’expression de LRPPRC et COX. Par ailleurs, les mécanismes de défense via l’AMPK en réponse au stress, notamment nutritionnel, semblent altérés dans les cellules LSFC.

Leigh syndrome French-Canadian type (LSFC) is an infantile mitochondrial disease caused by mutations in the LRPPRC gene resulting in a tissue-specific decrease in cytochrome c oxidase (COX) and fatal lactic acidosis crises which occur during stressful situations. The pathophysiology underlying this disease and the factors that precipitate these crises remain unknown. Thus, the main objective of this study was to explore adaptive mechanisms of energy metabolism. Our group demonstrated that COX deficiency in patients’ LSFC fibroblasts was associated with a reduction in oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in the absence of any changes in ATP levels. On the other hand, we have demonstrated that LSFC cells showed premature cell death when treated with 10 mM lactate and 1 mM palmitate (LP), a model of nutrient overload. We hypothesized that LSFC cells may display metabolic reprogramming under the control of the mamalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1), allowing for extra mitochondrial ATP synthesis. We also thought that alteration of the AMP activated protein kinase (AMPK) activity, an energy sensor, may contribute to the greater susceptibility of the LSFC cells to LP. Our results show that the Akt/mTORC1/p70S6K pathway is upregulated in LSFC cells relative to controls. This is associated with an increase in the expression of hypoxia inducible factor (HIF-1α) and its target pyruvate dehydrogenase kinase (PDHK1) resulting in an increase in the phosphorylated and inhibitory form of PDH1, the gatekeeper of mitochondrial glucose oxidation. Consistent with this, glucose contribution to the formation of pyruvate, alanine and lactate is increased in LSFC cells compared to controls. Unexpectedly, inhibition of mTORC1 by rapamycin has no effect on the expression of HIF-1α and PDHK1, nor on ATP levels in LSFC cells. However, it increases PDH1 phosphorylation and reduces the expression of LRPPRC and COX in LSFC cells. This is the first time that LRPPRC regulation by mTORC1 is reported. We have also studied the AMPK activation in response to various stresses. AMPK is activated in response to 2,4-dinitrophenol similarly both in control and LSFC cells. Treatment with LP, a nutritional stress, does not decrease ATP levels; but does induce phosphorylation of AMPK, and overexpression of SIRT1, COXIV and LRPPRC proteins in the control cells. Pretreatment with ZMP, an AMPK-specific activator, further increases the effects of LP. All these changes in response to LP are abolished in LSFC cells. Interestingly, treatment with 2-Bromopalmitate, a non-metabolizable analog of palmitate, does not induce the phosphorylation of AMPK in the control cells. These data suggest that palmitate metabolism is required for AMPK activation and this is prevented in LSFC cells. In conclusion, LSFC cells exhibit a Warburg-like metabolic reprogramming. mTORC1 doesn’t play a key role in maintaining ATP levels but its activation is required for LRPPRC and COX expression. Moreover, adaptive mechanisms in response to nutrient stress via AMPK, appear altered in the LSFC cells.