Effects of fibroblast growth factor 8 and 18 on ovine ovarian granulosa cell function

Abstract

Fibroblast Growth factors (FGFs) are growth factors which have diverse biological activities including broad mitogenic and cell survival activities. FGFs constitute a large family of 22 distinct polypeptide growth factors varying in size from 17 to 34 kDa and have between 13 to 71% sequence homology. More specifically, FGF8 and FGF18 are both important modulator of granulosa cell functions. FGF8 and FGF18 are homologous factors which possess similar sequence homology, but we hypothesized they may interact to FGFRs differently leading to distinct effects, particularly on granulosa cell growth and induce proliferation following a short period of exposition. This study was performed to investigate the effects of FGF8 and FGF18 on ovine granulosa cells proteome. Ovine ovaries were obtained from adult sheep’s irrespective of stage of estrous cycle and were cultured using a standard protocol. Granulosa cells were harvested from follicles then, seeded and cultivated. After, they were exposed to 10 ng/mL of FGF8 or FGF18. Cell proteins were extracted, cysteine bonds were reduced and acetylated and proteins were digested with trypsin. Tryptic peptides were analyzed using a bottom-up proteomic approach, mass spectrometry and a label-free quantitation method. The results obtained revealed following treatment with FGF8 or FGF18 for 30 minutes, an important shift toward upregulation for the entire granulosa cell proteome was measured. Additionally, several proteins, including ATF1, STAT3, MAPK1, MAPK3, MAPK14, PLCG1, PLCG2, PKCA, PIK3CA, RAF1, GAB1 and BAG2 were significantly upregulated (> 1.5-fold; p < 0.01). Results are suggesting the activation of the MAPK/ERK pathway as expected. However, it is important to note that ATF1 and STAT3 are important transcription factors involved in cell growth, proliferation and survival and consequently can hamper or rescue the normal ovine reproductive system function. Both are strongly interacting with the MAPK/ERK pathway. They are directly involved in the growth, proliferation and mechanisms of cell survival. This very significant increase of STAT3 and ATF1 could have important consequences on the viability of the oocyte.

La famille des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) comprend 22 membres. La masse moléculaire des FGFs varie de 17 à 34 kDa. Ces facteurs partagent une homologie de séquence en acides aminés (13% à 71%) ainsi qu’une homologie de structure. Durant le développement embryonnaire, les FGFs ont des rôles variés comme la régulation de la prolifération, de la migration, et de la différenciation cellulaire, et le maintien de l’intégrité vasculaire. Plus spécifiquement, FGF8 et FGF18 ont des effets significatifs sur la modification de la fonction des cellules granulosa de l’ovaire ovine. Notre hypothèse est que malgré une grande homologie de séquence, FGF8 and FGF18 vont produire des effets distincts sur les cellules de la granulosa qui pourront être caractérisés par une modulation du protéome. L'objectif de cette étude était de quantifier et comparer différentiellement l’expression du protéome des cellules de la granulosa suite à une exposition à FGF8 et FGF18. Les cellules de la granulosa récoltées chez des brebis, indépendamment du stade du cycle œstral ont été, extraites et cultivées en utilisant un protocole standard. Les cellules ont ensuite été exposées à 10 ng/mL de FGF8 ou FGF18 pendant 30 minutes. Les protéines ont été extraites, les ponts cystéinés réduits et acétylés pour que finalement les protéines soient digérées avec la trypsine. En utilisant une méthode « bottom-up », les peptides trytiques ont été analysés par spectrométrie de masse permettant l’identification et la quantification des protéines. Les résultats ont démontré qu’il y avait une augmentation signification de l’expression de l’ensemble des protéines présentes dans les cellules de la granulosa suite à l’exposition de ceux-ci à FGF8 et FGF18. Cette observation est cohérente avec une croissance cellulaire menant à une augmentation de la prolifération. De plus, l’expression de plusieurs protéines impliquées dans des voies de signalisation associées aux FGFR incluant spécifiquement ATF1, STAT3, MAPK1, MAPK3, MAPK14, PLCG1, PLCG2, PKCA, PIK3CA, RAF1, GAB1 et BAG2 a augmenté significativement (>1.5 fois ; p < 0.01). Tacitement, ces résultats suggèrent une activation de la voie MAPK/ERK cohérente avec ce qui est connu dans la littérature et nos hypothèses. De plus l’expression de deux facteurs de transcription, STAT3 et ATF1 ont été fortement augmentés. Ils sont directement impliqués dans la croissance, la prolifération et les mécanismes de survie cellulaire. Cette augmentation très significative de STAT3 et ATF1 pourrait avoir des conséquences importantes sur la viabilité de l’ovocyte.