Identification des composantes du système ubiquitine-protéasome régulant la stabilité de la MAPK atypique ERK3

Abstract

La kinase ERK3 est un membre atypique de la famille des MAP Kinases. Contrairement aux MAP Kinases conventionnelles qui peuvent phosphoryler une grande variété de substrats, et dont les fonctions sont bien définies, les déterminants moléculaires des fonctions de ERK3 restent peu caractérisés. Les études de la régulation de ERK3 font ressortir plusieurs particularités qui sont uniques au sein de la famille des MAP Kinases. ERK3 semblent être phosphorylée de manière constitutive sur sa boucle d’activation. De plus, ERK3 est une protéine hautement instable, qui est dégradée constitutivement par le système ubiquitine-protéasome. Cette régulation de la stabilité de ERK3 est un processus dynamique, car il peut être modulé par certains stimuli physiologiques. Il semble donc que la stabilité de la protéine ERK3 est un des régulateurs majeurs de son activité biologique. Toutefois, les composantes du système ubiquitine-protéasome qui contrôlent la stabilité de ERK3 restent à identifier. La première étude présentée décrit l’identification de la déubiquitinase USP20 comme un régulateur positif de la stabilité et de l’expression protéique de ERK3. Nos résultats indiquent que USP20 est une déubiquitinase de ERK3, en démontrant la relation enzymatique directe entre les deux protéines. Finalement, nous avons identifié une nouvelle fonction pour ERK3 dans le contrôle de la migration cellulaire et déterminé que USP20 est un régulateur positif de cette fonction cellulaire. Dans la deuxième étude nous décrivons la réalisation d’un crible fonctionnel pour identifier les ubiquitines ligases et conjugases qui régulent la dégradation de ERK3. Nos résultats décrivent la mise au point d’un système rapporteur de la stabilité protéique, utilisable dans les études automatisées à haut débit. Parmi les régulateurs identifiés, nos efforts se sont concentré sur l’ubiquitine ligase E6AP, dont nous avons démontré la fonction régulatrice de la stabilité et de l’expression protéique de ERK3. Finalement nous avons démontré que E6AP contrôle l’ubiquitination de ERK3. En conclusion, nos travaux ont permis d’identifier certains régulateurs de la stabilité de ERK3 et d’en caractériser des nouvelles fonctions. De plus, nos études fournissent des pistes d’études pour mieux comprendre les fonctions biologiques de ERK3, qui restent à l’heure actuelle encore peu définies.

ERK3 kinase is an atypical member of the MAP Kinase family. Conventional MAP Kinases phosphorylate a wide array of substrates and have well characterized functions whereas ERK3 biological activity is still poorly described. ERK3 regulations are unique among MAP Kinase family. Indeed, ERK3 seems constitutively phosphorylated on its activation loop. Moreover, ERK3 is a highly unstable protein, constitutively degraded by the ubiquitin-proteasome system. These observations suggest that ERK3 stability is a key regulator of its biological activity. Nonetheless, components of the ubiquitin-proteasome machinery regulating ERK3 turnover remain to be identified. The first part of my work identifies and characterizes USP20 deubiquitinase as a positive regulator of ERK3 protein expression and stability. By means of a direct enzymatic activity experiment, our results indicate that UPS20 is a bona fide deubiquitinase of ERK3. Finally, we identified a novel function of ERK3 in the control of cell migration and we determined the involvement of USP20 as an upregulator of this cellular function. The second part of my research illustrates the product of a functional screen that identifies ubiquitin ligases and conjugases regulating ERK3 degradation. Our results discuss the development of a reporter system of protein turnover, suitable for high-throughput experiments. Among the identified regulators, we focused on E6AP ubiquitin ligase, for which we showed a function in the regulation of ERK3 protein abundance and turnover. Ultimately, we demonstrated the E6AP controls ERK3 ubiquitination. In conclusion, our work permits the identification of regulators of ERK3 protein stability and characterization of new cellular functions. Moreover, this study provides innovative avenues to better understand the biological activity of ERK atypical MAP Kinase.