Vérification de la corrélation entre la fonction, la structure et la dynamique sur un chemin évolutif recombinant les β-lactamases TEM-1 et PSE-4

Abstract

La corrélation, déjà bien établie, entre la structure et la fonction des enzymes a permis d’expliquer le mécanisme catalytique de plusieurs d’entre elles. Toutefois, des lacunes entourant l’explication de leur capacité à accélérer, si drastiquement, la vitesse réactionnelle subsistent toujours. L’une des hypothèses propose l’inclusion d’un rôle fonctionnel aux mouvements présents dans les enzymes. Un nombre grandissant d’évidences montrant un lien entre la dynamique et la fonction des protéines nous poussent, ici, à vérifier la présence d’une telle corrélation dans un contexte évolutif et à vérifier si la dynamique devrait être prise en compte afin de mieux faire l’ingénierie des enzymes. Le modèle enzymatique étudié sera composé de deux β-lactamases naturellement évoluées et homologues, TEM-1 et PSE-4. Par la caractérisation de ces deux enzymes, structurellement et fonctionnellement similaires, nous avons observé que TEM-1 et PSE-4 possèdent une dynamique similaire, généralement restreinte, sur les échelles de temps allant des picosecondes aux millisecondes. Ces résultats supportent l’hypothèse selon laquelle la dynamique a été évolutivement maintenue dans ces enzymes, et suggèrent que celle-ci possède un rôle envers la fonction enzymatique, d’où son maintien au cours de l’évolution. En laboratoire, plusieurs approches peuvent être utilisées afin de faire l’ingénierie des protéines. La recombinaison d’homologues est grandement utilisée, puisque cette méthode, mimant le processus naturel d’évolution par recombinaison, permet d’intégrer un grand nombre de mutations simultanées qui ont déjà été sélectionnées au cours de l’évolution. Notre modèle enzymatique sera constitué de trois enzymes chimériques issues de la recombinaison des β-lactamases TEM-1 et PSE-4. Ces enzymes représentent de potentiels intermédiaires évolutifs entre ces deux enzymes naturellement évoluées. Ces trois chimères ont été sélectionnées en fonction de leur site actif ayant été recombiné. Nos résultats démontrent une conservation de l’efficacité catalytique, de la structure et de la dynamique rapide chez ces trois chimères. Toutefois, des changements importants de dynamique lente, coïncidant avec l’échelle de temps de la vitesse catalytique de ces enzymes, ont été observés. Une exploration in silico des conformations adoptées par les chaînes latérales des résidus catalytiques montre des variations corrélant aux légères variations fonctionnelles (diminution du kcat pour l’hydrolyse des céphalosporines) entre les β-lactamases TEM-1, PSE-4 et ces chimères. Ces résultats mettent en évidence l’importance de caractériser les mouvements ayant lieu sur plusieurs échelles de temps afin de pouvoir comprendre leur rôle et de considérer ceux-ci relativement à la fonction de la protéine. Nous proposons ici que la dynamique rapide de ces enzymes est impliquée au niveau de leur réactivité hydrolytique (c’est-à-dire hydrolyser un β-lactame) alors que la dynamique lente pourrait être impliquée au niveau de la grande adaptabilité évolutive (reconnaissance non native de nouveaux antibiotiques de type β-lactame) de ces enzymes de résistance bactérienne.

The link between enzyme structure and function is well established and has led to the description of many catalytic mechanisms. However, how enzymes accelerate the catalytic rate so drastically is still not fully understood. A growing amount of evidence linking protein dynamics to function, suggests that protein motions might have functional implications. This compels us to verify this correlation in an evolutionary context and to verify if protein dynamics should be considered to better engineer enzymes. Our studied enzymatic model is composed of two homologous and naturally evolved bacterial resistance enzymes, the TEM-1 and PSE-4 β-lactamases. By characterizing these structurally and functionally similar enzymes, we verified if protein dynamics are evolutionarily conserved. Our results show that TEM-1 and PSE-4 maintain similar patterns of restricted dynamics on timescales ranging from picoseconds to milliseconds. This supports the hypothesis that dynamics have been evolutionarily maintained in these enzymes and is consistent with a contribution of dynamics to enzyme function resulting in the evolutionary maintenance of dynamics. Various approaches are used to engineer proteins. Homologous recombination is extensively applied, as it mimics natural evolution. This technique allows the incorporation of many simultaneous sequence variations selected over the course of evolution. Our enzymatic model includes three chimeric enzymes, resulting from the recombination of TEM-1 and PSE-4. These represent intermediates over a hypothetical evolutionary path from TEM-1 to PSE-4. These artificially-evolved enzymes were selected to compose this system of evolutionarily related protein on the basis of their active site cavity having been recombined. A conservation of function, structure and fast dynamics was found in these chimeras. Striking variations of slow dynamics, occurring on a timescale coinciding with the catalytic turnover rate, were also observed. In silico exploration of the conformations adopted by the catalytic residue side-chains showed variations correlating with the functional diversification between TEM-1, PSE-4, and the chimeric β-lactamases. These results highlight the importance of probing motions on various timescales to fully comprehend their role in function. We propose that dynamics on the faster timescales are associated with the maintenance of reactivity in these enzymes, while modification of the slow dynamics may be associated with the high evolvability of these bacterial resistance enzymes.