Nouvelles stratégies analytiques favorisant l’augmentation de la spécificité et de la sensibilité en imagerie MS

Abstract

La spectrométrie de masse est une technique analytique permettant de mesurer le ratio masse sur charge d’un ion. Cette technique, très répandue en chimie analytique permet d’élucider la composition moléculaire de mélanges complexes à partir de systèmes homogénéisés. De ce fait, toute l’information sur la distribution spatiale des molécules est perdue. L’imagerie par spectrométrie de masse (IMS) a été inventée afin de résoudre ce problème et permettre d’élucider la distribution spatiale de molécules cibles sur des sections tissulaires minces provenant de tissus biologiques tels que de mammifères ou de plantes. L’un des grands avantages de l’IMS est sa complémentarité à l’histopathologie, technique permettant de révéler la structure ainsi que la localisation de certaines biomolécules à partir de sections tissulaires minces. Cependant, cette dernière se limite principalement aux protéines et aux molécules pouvant avoir une interaction spécifique avec un anticorps. L’IMS permet la détection d’une vaste gamme de biomolécules allant des petits métabolites aux polymères de haut poids moléculaire. Parmi les biomolécules détectables par IMS, les lipides attirent de plus en plus l’attention des analystes. En effet, ils occupent différentes fonctions clés au sein des systèmes biologiques, autant structurales que métaboliques, comme constituants des parois cellulaires, acteurs de la signalisation cellulaires ainsi que dans le stockage d’énergie. Leur intérêt est d’autant plus important qu’aucune technique histologique classique ne permet actuellement de détecter de façon spécifique les différentes classes de lipides. De façon générale, l’IMS de lipides est effectuée en utilisant la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI). Ce procédé permet de révéler l’emplacement de ii différentes classes de molécules en exploitant l’affinité que ces dernières ont pour une matrice particulière. Au-delà du choix de la matrice, d’autres paramètres tels que le mode de déposition de la matrice, le choix des solvants ainsi que le type de lavage utilisé vont également affecter le type de molécules détectés lors d’une analyse MALDI. Malgré les très bonnes performances du MALDI pour l’analyse de lipides, ce mode d’analyse se limite souvent aux lipides polaires facilement ionisables. Les lipides neutres comme le cholestérol (CHO) et les triacylglycérols (TAGs) sont impliqués à différents niveaux de fonctions biologiques fondamentales. Ainsi, nous avons développé trois stratégies permettant l’analyse de ces lipides neutres et de faibles abondances comme les gangliosides, directement à partir de sections tissulaires minces par MALDI ainsi que par désorption-ionisation laser classique (LDI). L’implication du cholestérol en tant que molécule structurale et précurseur de la synthèse de diverses hormones et vitamines, en fait une cible de choix pour l’analyse par IMS. Historiquement, l’analyse du cholestérol par MALDI permettait de le détecter sous sa forme déshydratée. De ce fait, il était impossible de le distinguer des autres métabolites tels que ses esters qui produisaient le même fragment. Afin de permettre l’IMS du cholestérol intact nous avons développé une nouvelle technique de préparation d’échantillons reposant sur le dépôt d’une couche nanométrique d’argent (16±2 nm) sur une section tissulaire mince par pulvérisation. Cette technique permet d’ioniser spécifiquement le cholestérol intact ainsi que divers acides gras sous forme d’adduits d’argent, et ce, avec une haute résolution spatiale (5 µm). iii Au-delà du cholestérol et des acides gras, une autre classe de lipides neutres très abondants, les triglycérides, reste difficilement analysable par MALDI IMS. En effet, les TAGs constituent la principale classe de lipides impliqués dans le stockage énergétique au niveau cellulaire. Ce rôle comme source d’énergie fait des TAGs un acteur incontournable de plusieurs maladies métaboliques telles que la stéatose hépatique, l’athérosclérose ainsi que la maladie d’Alzheimer. La difficulté d’analyser les TAGs par IMS provient de leur fragilité en milieu acide ainsi que de leur faible tendance à former des adduits sodium nécessaire à leurs analyses. En considérant ces limites, nous avons développé une méthodologie de préparation d’échantillon en deux étapes permettant l’analyse hautement spécifique des TAGs par LDI IMS. Dans un premier temps, les sections tissulaires minces sont initialement exposées à une solution aqueuse contenant un tampon carbonate à base de sodium (pH 10.3, 85 mM) ainsi que d’acétate de sodium (250 mM) afin de facilité la formation d’adduit sodium et de limiter la fragmentation des TAGs en source. Par la suite, une couche nanométrique d’or (28±3 nm) est déposée sur la section afin de permettre l’analyse des TAGs par IMS à haute résolution spatiale (> 10 µm). Lorsque ces derniers ont une abondance réduite dans les sections tissulaires, cette méthode permet aussi l’analyse d’esters de cholestérol (CE). La maladie de Hunter est une maladie génétique caractérisée par l’accumulation de glycosaminoglycanes (GAGs) ainsi que de l’accumulation secondaire de gangliosides. Ce phénomène est dû à l’absence de l’enzyme iduronate-2-sulfatase (IdS) qui permet la dégradation des GAGs. L’accumulation des GAGs et des gangliosides a pour conséquence l’apparition de problèmes fonctionnels et neurologiques majeurs entrainant la mort. Il existe une thérapie de remplacement enzymatique où une forme recombinante de l’enzyme IdS est injectée aux patients. Cette thérapie permet de rétablir le métabolisme normal des GAGs et iv gangliosides dans tous les organes sauf le cerveau où la barrière hémato-encéphalique empêche l’IdS recombinante d’atteindre les zones affectées. L’étude de la composition moléculaire des dépôts de GAGs et gangliosides au niveau cérébral constitue un défi important afin de comprendre la progression des troubles neurologiques engendrés par cette accumulation. À cette fin, nous avons développé une méthode MALDI spécifique à l’analyse des gangliosides à partir de sections tissulaires minces de cerveau de souris simulant la maladie Hunter (IdS-KO). Cette méthode d’analyse par MALDI IMS permet une révélation immuno-histochimique (IHC) des dépôts suivant l’analyse IMS. Nous avons pu visualiser cinq types de gangliosides dont quatre spécifiques au dépôt présent dans les cerveaux révélés par IHC sur la même section tissulaire. Cette étude nous a permis de distinguer pour la première fois des GM3 et GM2 selon la composition de leur chaine latérale et non de leur chaine polysaccharidique révélée par l’analyse IHC.

Mass spectrometry (MS) is an analytical technique that measures the mass-to-charge ratio of ions. This technique is widely used in analytical chemistry to solve the molecular composition of complex homogenized samples. The use of homogenized samples means that all the information with respect to the initial distribution of analytes is lost. Imaging mass spectrometry (IMS) is an MS technique which is able to provide the spatial localization of a given analyte on a surface, such as thin tissue sections from various animal sources. One of the greatest advantages of IMS is its complementarity with histopathology which normally reveals the general structure of thin tissue sections as well as the localization of certain biomolecules such as proteins or of any molecules capable of specific interactions with an antibody. On the other hand, IMS is capable of imaging a wide variety of biomolecules ranging from small metabolites to the high molecular weight proteins and polymers. Among these, lipids are of particular interest for their key involvements in many biological processes. Their interest is even greater when considering that lipid imaging by classical histology is unable to differentiate between all lipid species. IMS of lipids is typically performed using matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI). MALDI IMS can differentiate various classes of lipids and their localization within a thin tissue section by taking advantage of the specific affinity that different classes of lipids have for different matrices. The matrix deposition process, along with the choice of solvents, are key parameters that need to be considered in MALDI IMS. While MALDI offers great coverage of the phospholipidome, it fails miserably for neutral lipid analysis. Indeed, cholesterol and triacylglycerols (TAGs) are two classes of neutral lipids with very important vi biological roles which are extremely difficult to image by MALDI. We have developed three new strategies that enables the detection of neutral lipids, some of which are expressed in low abundance such as gangliosides, directly from thin tissue section using either MALDI or laser desorption/ionization (LDI). Cholesterol is a precursor of many key biomolecules such as vitamins and hormones. It’s also a major component of the cellular membrane. MALDI IMS allows in some cases imaging of the dehydrated form of cholesterol. Unfortunately, detecting cholesterol as such makes it impossible to distinguish some of its metabolites which ionize in a similar fashion and dissociate to produce the same ions. To address this issue, we have developed a new sample preparation method involving the deposition of a nanometer scale silver layer (16±2 nm) over a thin tissue section. This enables the detection by LDI MS of intact cholesterol and some fatty acid species as silver adducts with up to 5 µm in spatial resolution. Beyond cholesterol and fatty acids, TAGs is another class of highly abundant neutral lipids still poorly detected by MALDI IMS. As TAGs are the main molecules involved in energy storage of cells, they have been implicated in many metabolic diseases such as non- alcoholic fatty liver disease, atherosclerosis and even Alzheimer’s disease. The reason why TAGs are poorly detected by MALDI comes from two key factors. First, TAGs are unstable in acidic environments, typical of MALDI matrices. Second, competition effects for the ionizing proton provided by the MALDI matrix prevent TAGs from easily ionizing through this main ionization process. To overcome these limitations, we have developed a new two-step sample preparation method for TAG LDI IMS. We initially deposited a solution of carbonate buffer (pH 10.3, 85 mM) and sodium acetate (250 mM) on the tissue section to increase the amount vii of available sodium for enhanced TAG ionization. The second step consisted of sputtering a nanometer scale UV absorbing gold layer (28±3 nm) that allows for the detection of TAGs by LDI IMS with spatial resolution as low as 10 µm. When TAGs are present in low amounts in the tissue section, this method also enables the detection of cholesterol esters. Hunter’s disease is a genetic disease characterized by the abnormal accumulation of glucoaminoglycans (GAGs) and the secondary accumulation of gangliosides due to the lack of iduronate-2-sulfatase (IdS) enzyme which controls their degradation. The accumulation of both GAGs and gangliosides form deposits which induces various functional issues to different organs as well as neurologic disorders. To minimize these effects, an enzyme replacement therapy has been developed. Unfortunately, it shows efficacy in all organs except the brain due to the inability of the recombinant enzyme to cross the blood-brain barrier. To further our knowledge of the progression of the disease, using a mouse model of Hunter’s disease we have developed a MALDI based method to specifically image gangliosides in brain deposits with a spatial resolution of 5 µm. This method also permits subsequent ganglioside staining by immunohistochemtry of the tissue section. With this method, we have identified four types of ganglioside which are specific to the Hunter’s disease pathology. We were also able to detect two types of deposits, one which is enriched in short chain gangliosides and the other in long chain gangliosides.