Analyse fonctionnelle des polymorphismes du virus du papillome humain de type 33

Abstract

L’infection au virus du papillome humain oncogénique (VPH-HR) est associée au développement du cancer du col de l’utérus. L’expression des oncogènes viraux E6 et E7, qui favorisent la progression vers le cancer, est régulée par la région de contrôle longue ou LCR qui contient des sites de liaison pour plusieurs facteurs de transcription cellulaires et pour le répresseur viral E2. L’expression des oncogènes E6 et E7 est souvent dérégulée dans les cancers du col de l’utérus, une résultante de l’intégration du génome viral qui détruit fréquemment le cadre de lecture du gène E2. Plusieurs isolats ou variantes du VPH de type 33 (VPH33) avec une séquence nucléotidique du LCR différente du prototype ont été identifiés dans des spécimens de femmes infectées par le VPH et présentant des lésions intraépithéliales au niveau du col utérin. Deux polymorphismes, une délétion de 79 pb et la transversion C7732G, ont été associés à la persistance de l’infection et à un plus grand risque de développer une lésion intraépithéliale de haut-grade, respectivement. L’effet fonctionnel des polymorphismes du LCR du VPH33 sur l’expression génique virale, en particulier de la délétion de 79 pb et de C7732G, n’a jamais été caractérisé. Dans une première étude, l’activité transcriptionnelle des variantes de LCR du VPH33 a été comparée à celle du prototype dans les lignées cellulaires C33A et HeLa par des études de gènes rapporteurs suite à leur introduction en amont du gène de la Renilla luciférase. Nos résultats indiquent que l’activité transcriptionnelle des variantes du LCR du VPH33 reflète leur classification phylogénétique; les variantes issues de la lignée A2 étant les plus actives dans les C33A que le prototype du groupe A1. Des analyses par mutagenèse dirigée ont établi que l’activité accrue des LCRs de ces variantes est due à plusieurs variations, incluant la délétion de 79 pb et C7732G, et dont leur effet individuel est assez modeste. Dans les cellules HeLa, les niveaux de transcription des variantes de la lignée A2 étaient similaires à ceux observés chez le prototype. Cet effet a été attribué à la variation A7879G qui induit la répression du LCR dans ces cellules. Ces résultats indiquent que la combinaison de plusieurs variations dites faibles altère significativement l’activité transcriptionnelle du LCR du VPH33.

D’un autre côté, les résultats rapportés dans notre deuxième étude indiquent que la mutation d’un élément important pour la régulation de la transcription virale peut tout autant altérer l’activité du LCR. La variante rare LCR10 de la lignée B montre une activité transcriptionnelle accrue comparée au prototype. Des analyses par mutagenèse dirigée ont identifié la variation T7791C comme étant responsable de l’activité augmentée du LCR10. L’effet stimulateur de ce polymorphisme est dû au fait qu’un site répresseur pour le facteur cellulaire C/EBPβ est aboli, tel que déterminé par des essais de liaison à l’ADN in vitro et de gène rapporteur. Un deuxième site C/EBPβ a également été identifié, cette fois-ci, agissant comme activateur de l’expression génique. Finalement, dans une troisième étude, nous montrons que C/EBPβ est un régulateur commun de l’expression des gènes chez les VPHs oncogéniques. Effectivement, plusieurs sites C/EBPβ sont retrouvés dans la région amplificatrice du LCR des VPHs à haut-risque tel que déterminé par des prédictions basées sur des matrices d’énergie et de fréquence. Certains de ces éléments sont similaires aux sites répresseurs et activateurs retrouvés dans le VPH33. Dans l’ensemble, nos études démontrent l’importance de caractériser l’effet individuel des polymorphismes du LCR pour mieux comprendre les mécanismes de modulation de la transcription des VPHs. De plus, nous montrons que C/EBPβ joue un rôle central autant dans la répression que dans l’activation de l’expression des gènes viraux.

The infection by the oncogenic human papillomavirus (HR-HPV) is associated with the development of cervical cancer. The expression of the E6 and E7 viral oncogenes favors progression towards cancer and is driven by the long control region (LCR) which contains binding sites for both cellular factors and the viral E2 protein. The expression of these oncogenes is often upregulated in cervical cancer due to the integration of the viral genome which frequently disrupts the open reading frame of the repressor E2 gene. Several isolates or variants of HPV type 33 (HPV33) with a slightly different nucleotide sequence were previously identified in clinical samples from women infected with HPV33 and presenting squamous intraepithelial lesions of the uterus. Two polymorphisms, a 79-bp deletion and the C7732G transversion, were previously associated with an increased risk of persistence of infection and of developing high-grade lesions, respectively. The functional effect of polymorphisms in the HPV33 LCR on viral gene expression has never been assessed in particular for the 79-bp deletion and C7732G. In the first study presented here, the transcriptional activity of the HPV33 LCR variants were compared to that of the prototype in C33A and HeLa cell lines using gene reporter assays following their introduction upstream of the Renilla luciferase. Our results indicate that the LCR activity of the variants reflects their phylogenetic classification. As such, variants from the A2-sublineage were the most active in C33A cells when compared to the A1-sublineage prototype. Mutational analysis showed that the increased in LCR activity was the result of several weakly-acting variations, including the 79-bp deletion and C7732G. In HeLa cells, the lower transcriptional activity of the A2 variants was caused by A7879G which induces repression of the LCR in these cells. These results show that the combination of weakly-acting variations in the LCR significantly alters viral gene expression. In the second study, we show that the mutation of important regulatory elements also significantly enhances the transcriptional activity of the LCR. The rare HPV33 LCR10 variant from the B lineage exhibits increased transcriptional activity compared to the prototype. Mutational analysis shows that the T7791C variation is responsible for this phenotype. The stimulating effect of this variation is caused by the disruption of a repressor C/EBPβ site as determined in an in vitro DNA-binding assay and gene reporter assays. A second site necessary this time for the activation of the LCR was also identified. Finally, in the third study, we show that C/EBPβ is a common regulator of the oncogenic HPV gene expression. Several C/EBPβ sites were found in the enhancer region of the LCR of these HPV types as determined by our prediction using both energy- and frequency-based matrices. Some of these sites were found to be similar to the repressor and activating sites in the HPV33 LCR. Taken together, our studies highlight the importance of characterizing individual variations in the LCR in order to improve our knowledge on the mechanisms involved in the regulation of viral gene expression. We also show that the activating and inhibitory functions of C/EBPβ are important for the modulation of viral transcription.