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dc.contributor.advisorHickson, Gilles
dc.contributor.authorDragieva, Zlatina
dc.date.accessioned2016-11-15T18:42:58Z
dc.date.availableNO_RESTRICTIONfr
dc.date.available2016-11-15T18:42:58Z
dc.date.issued2016-10-13
dc.date.submitted2016-06
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/1866/16242
dc.subjectseptinefr
dc.subjectactinefr
dc.subjecttubesfr
dc.subjectanneauxfr
dc.subjecthautementfr
dc.subjectorganisésfr
dc.subjectcomplexesfr
dc.subjecthexamèrefr
dc.subjectactinfr
dc.subjectseptinfr
dc.subjecttubefr
dc.subjectringfr
dc.subjecthigher-orderfr
dc.subjecthexamerfr
dc.subject.otherBiology - Molecular / Biologie - Biologie moléculaire (UMI : 0307)fr
dc.titleCaractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actinefr
dc.typeThèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation
etd.degree.disciplineBiologie moléculairefr
etd.degree.grantorUniversité de Montréal (Faculté de médecine)fr
etd.degree.levelMaîtrise / Master'sfr
etd.degree.nameM. Sc.fr
dcterms.abstractLes septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.fr
dcterms.abstractSeptins are highly conserved GTP-binding proteins deregulated in diseases such as cancer and neurodegenerative diseases. Septins scaffold other proteins and act as diffusion barriers at the plasma membrane and midbody during cytokinesis. They interact with the actin cytoskeleton and have been observed to form ordered complexes that can polymerize into higher-order structures such as filaments and rings. The principles of assembly and disassembly of such filaments and rings and their cellular roles are yet to be elucidated. Drosophila offers a simple system, as there are only 5 septin genes: peanut, sep1, sep2, sep4, and sep5 in contrast to 13 found in humans. We have previously found that Drosophila S2 cells contain unusual tubular structures that label with Peanut antibody. The goal of my Master’s project has been to characterise these structures, by defining their constituents, behaviours and properties, in the hope that this will shed light on the mechanisms by which septins can form higher-ordered structures and how they interact with other cytoskeletal elements such as actin. Using fluorescence microscopy, I show that these tubes are cytoplasmic and present in 30% of cells, both during mitosis and interphase, suggesting they are not cell cycle regulated. To investigate their composition and dynamic properties, I generated S2 cell lines stably expressing Sep2-GFP, which localizes to septin tubes and double stranded RNAs against all septins. The products of three septin genes were found to be essential for the assembly of septin tubes: Sep1, Sep2, and Pnut. The depletion of Sep1 led to the dispersal of the GFP signal into cytoplasmic clumps, whereas the depletion of Sep2 and Pnut led to its uniform distribution through the cell. FRAP analysis of Sep2-GFP revealed only slow recovery after many hours, indicating that the structures are very stable. I also discovered an unusual relationship between septin tubes and the actin cytoskeleton. Although the tubes did not label with conventional F-actin probes (Phalloidin, LifeAct), treatment with inhibitors of F-actin assembly (Latrunculin A) or disassembly (Jasplakinolide) led to their rapid (<30 min) dispersal into scattered rings. Furthermore, overexpressed Actin05C-mCherry localised to the septin tubes, while a polymerization-deficient mutant Actin05C-R62D-mCherry did not. Depletion of the actin severing protein Cofilin and the actin capping protein AIP1 also disrupted septin tubes dispersing them into cytoplasmic rings. A dynamic actin cytoskeleton is thus required for the formation and/or maintenance of higher ordered structures such as rings and tubes. Conclusion and Relevance: Ongoing studies aim to further elucidate how septins organize into such ordered structures and how actin regulates the process. This will clarify the septin network of interactions and facilitate the comprehension of their implication in cancer and neurodegenerative diseases. Key words: actin, septin, tube, ring, higher-order, hexamer, cofilin, AIP1fr
dcterms.languagefrafr


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