Création de mutants cdc5 en vue de l’identification des substrats de PLK/Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN

Abstract

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.

Polo-like kinases (PLK) play a crucial role during the cell cycle, especially in promoting essential processes such as M phase entry and mitotic exit. They are also involved in many cancers and are highly tumorigenic. Recently, our laboratory showed that Cdc5 (i.e., the Polo-kinase of Saccharomyces cerevisiae) was required for the adaptation response to DNA damage, and that the target of Cdc5 during this process would localize to the yeast centrosomes and might be a less conventional substrate. In order to identify it, an in vivo analysis of the whole phosphoproteome of PLK/Cdc5 by mass spectrometry has to be to done. Accordingly, a thermosensitive allele of CDC5, i.e. a mutant version that can be inactivated at high temperature, has to be used. This allele has to be thermosensitive at 30°C, in order to make sure that only cdc5 will be inactivated and that only its substrates will be identified. For this purpose, we created two cdc5 alleles that were thermosensitive at 30°C: cdc5-17 and cdc5-18, and then we analyzed their cell cycle at 32°C. The results of this analysis showed that cells exposure to 32°C resulted in their arrest at the end of the cell cycle as large-budded cells, which points towards a defect in the promotion of mitosis exit. This defect is due to the mutation of CDC5 whose protein allows the exit from mitosis via two pathways: the MEN pathway (Mitotic Exit Network) and the FEAR pathway (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 and cdc5-18 represent precious biological tools that will allow us to analyze PLK/Cdc5 phosphoproteome and to identify Cdc5 targets during the adaptation response to DNA damage. Since the adaptation to DNA damage caused by chemotherapeutic agents is considered one of the factors promoting cancer tumors proliferation, this discovery will be a huge step in the fight against cancer.