Modèle cellulaire de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH
dc.contributor.advisor | Christopoulos, Apostolos | |
dc.contributor.advisor | Rodier, Francis | |
dc.contributor.author | Knapik, Monika | |
dc.date.accessioned | 2016-04-12T15:23:51Z | |
dc.date.available | NO_RESTRICTION | fr |
dc.date.available | 2016-04-12T15:23:51Z | |
dc.date.issued | 2016-03-17 | fr |
dc.date.submitted | 2014-04 | |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/1866/13405 | |
dc.subject | VPH | fr |
dc.subject | Cancer oropharynx | fr |
dc.subject | Modèle cellulaire | fr |
dc.subject | Carcinogenèse | fr |
dc.subject | HPV | fr |
dc.subject | Oropharyngeal cancer | fr |
dc.subject | Cellular model | fr |
dc.subject | Carcinogenesis | fr |
dc.subject.other | Health Sciences - Medicine and Surgery / Sciences de la santé - Médecine et chirurgie (UMI : 0564) | fr |
dc.title | Modèle cellulaire de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH | fr |
dc.type | Thèse ou mémoire / Thesis or Dissertation | |
etd.degree.discipline | Sciences biomédicales | fr |
etd.degree.grantor | Université de Montréal | fr |
etd.degree.level | Maîtrise / Master's | fr |
etd.degree.name | M. Sc. | fr |
dcterms.abstract | Problématique: Le virus du papillome humain (VPH) est présent dans près de 50% des cancers de l’oropharynx. Le potentiel oncogénique du VPH est encodé dans les oncoprotéines E6 et E7, qui agissent en modulant différents gènes, dont les gènes suppresseurs de tumeur p53 et pRb. Les cellules VPH positives démontrent une altération au niveau de la signalisation de la réponse aux dommages à l’ADN (RDA), un mécanisme de contrôle dans l’arrêt de la croissance des cellules ayant subit des dommages au niveau de leur ADN. Hypothèse et objectifs : Nous croyons que les défauts au niveau de la RDA des cancers VPH positifs peuvent être exploités afin de sensibiliser préférentiellement les cellules cancéreuses aux traitements de radiothérapie. Cette stratégie de recherche nécessite l’élaboration d’un modèle cellulaire de carcinogenèse isogénique pour le cancer de l’oropharynx que nous proposons de développer et de caractériser. L’étude vise à dériver des lignées isogéniques à partir de kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx pour ensuite valider la carcinogenèse de notre modèle in vitro & in vivo Méthodologie : Des lignées cellulaires de kératinocytes primaires et de cellules épithéliales de l’oropharynx ont été successivement modifiées par transduction afin de présenter les mutations associées aux cancers de l’oropharynx induits par le VPH. Les cellules ont été modifiées avec des lentivirus codants pour la télomérase (hTERT), les oncogènes E6, E7 et RasV12. Afin de valider la cancérogenèse in vitro de notre modèle, des études d’invasion en matrigel et de croissance sans ancrage en agar mou ont été réalisées. Les populations cellulaires transformées ont été ensuite introduites dans des souris immunodéficientes afin d’évaluer leur tumorogénicité in vivo. Résultats : À partir des plasmides recombinés construits par méthodes de clonage traditionnelle et de recombinaison « Gateway », nous avons produit des lentivirus codants pour la télomérase humaine (hTERT), les oncogènes viraux E6 et E7 et l’oncogène Ras. Les kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx ont été infectés successivement par transduction et sélectionnés. Nous avons validé l’expression de nos transgènes par méthode d’immunofluorescence, de Western Blot et de réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel (qRT-PCR). Nous avons établi trois lignées des cellules épithéliales de l’oropharynx (HNOE) à partir d’échantillons tissulaires prélevés lors d’amygdalectomie (HNOE42, HNO45, HNOE46). Les cellules transduites avec le lentivirus exprimant le promoteur fort CMV/TO de l’oncogène RasV12 ont présenté un changement morphologique compatible avec une sénescence prématurée induite par l’oncogène Ras. En exprimant des quantités plus faibles du RasV12 mutant, la lignée cellulaire HEKn hTERT-E6-E7 PGK RasV12 a réussi à échapper à la sénescence induite par l’oncogène Ras. La population cellulaire exprimant HEKn hTERT-E6-E7-PGK RasV12 a présenté un phénotype malin en culture et à l’étude d'invasion, mais n’a pas démontré de résultats positifs à l’étude de croissance sans ancrage en agar mou ni en xénogreffe en souris immunodéficientes. Conclusion : Nos résultats démontrent qu’en présence des oncogènes viraux E6 et E7, il y a un troisième mécanisme suppresseur de tumeur qui médie la sénescence induite par l’oncogène Ras. Nous avons identifié que la présence de E6 seule ne suffit pas à immortaliser les kératinocytes primaires humains (HEKn). Nous n’avons pas réussi à créer un modèle in vitro de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH. | fr |
dcterms.abstract | Background: Human papillomavirus (HPV) is present in almost 50% of all oropharyngeal cancers. The oncogenic potential of HPV is encoded by the E6 and E7 oncoproteins, which act by modulating different genes, including tumour suppressor genes p53 and pRb. The process of inactivation of p53 and pRb is largely responsible for the genomic instability that contributes to malignant transformation of cells. HPV-positive cancer cells show an alteration in their DNA Damage Response (DDR) signalling pathway that allows them to inhibit key tumour suppressor genes and to ignore DNA damage signals. Hypothesis and objectives: We believe that these DDR defects can be exploited to preferentially sensitize cancerous cells to radiotherapy by using a defined cell culture model. We propose to characterize a defined cell culture model for HPV induced oropharyngeal cancer. Derive isogenic cell culture lines from primary skin keratinocytes and oropharyngeal epithelial cells. and to validate the carcinogenesis of our model in vitro and in vivo. Methods: We propose to use primary skin keratinocytes and oropharyngeal epithelial cells which will be sequentially modified by transduction using a Gateway Lentiviral System to present the mutations associated with HPV induced oropharyngeal cancer. The cells will be modified with lentivirus encoding the human telomerase (hTERT), E6, E7 and Ras oncogenes. To validate the in vitro carcinogenesis of our model, we will assess anchorage independent growth and invasiveness by means of soft agar medium and matrigel studies. To assess in vivo tumorigenicity, the transformed cell populations will be introduced into immunodeficient mice. Results: We constructed recombinant lentivector plasmids using traditional cloning and Gateway recombination methods. Using the constructed lentivectors, we generated lentiviruses encoding the catalytic subunit for human telomerase (hTERT), the E6 and E7 viral oncogenes and Ras oncogene. Primary keratinocytes and oropharyngeal epithelial cells were infected successively by transduction with the above-mentioned lentiviruses and then underwent selection. We validated the expression of our transgenes by methods of immunofluorescence, Western blot and real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). We have successfully established and kept in culture three lines of epithelial oropharyngeal cells (HNOE42, HNOE45, HNOE46) from tissue samples collected during tonsillectomy. Cells transduced with lentivirus expressing CMV/TO, a strong promoter for the RasV12 oncogene, showed morphological changes compatible with premature Ras oncogene induced senescence. Cell line HEKn hTERT-E6-E7 PGK RasV12 managed to escape Ras oncogene induced senescence by expressing lower amount of mutated RasV12. The HEKn hTERT-E6-E7-PGK RasV12 cell line presented a malignant phenotype in culture and on matrigel invasion assay. However, soft agar assay for anchorage independent cell growth and xenograft assay in immunodeficient mice were both negative for tumorigenicity. Conclusion: Our results demonstrate that in the presence of E6 and E7, a third tumor suppressor mechanism mediates Ras oncogene induced senescence. Furthermore, we have found that the presence of E6 alone is not sufficient to immortalize primary human keratinocytes (HEKn). We have not managed to create an in vitro carcinogenesis cell culture model for HPV induced oropharyngeal cancer. | fr |
dcterms.language | fra | fr |
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