Liens externes
  • Directories
  • Faculties
  • Libraries
  • Campus maps
  • Sites A to Z
  • My UdeM
    • Mon portail UdeM
    • My email
    • StudiUM
Dessin du pavillon Roger Gaudry/Sketch of Roger Gaudry Building
University Home pageUniversity Home pageUniversity Home page
Papyrus : Institutional Repository
Papyrus
Institutional Repository
Papyrus
    • français
    • English
  • English 
    • français
    • English
  • Login
  • English 
    • français
    • English
  • Login
View Item 
  •   Home
  • Faculté de médecine
  • Faculté de médecine – Thèses et mémoires
  • View Item
  •   Home
  • Faculté de médecine
  • Faculté de médecine – Thèses et mémoires
  • View Item
JavaScript is disabled for your browser. Some features of this site may not work without it.

My Account

To submit an item or subscribe to email alerts.
Login
New user?

Browse

All of PapyrusCommunities and CollectionsTitlesIssue DatesAuthorsAdvisorsSubjectsDisciplinesAffiliationTitles indexThis CollectionTitlesIssue DatesAuthorsAdvisorsSubjectsDisciplinesAffiliationTitles index

Statistics

View Usage Statistics
Show metadata
Permalink: http://hdl.handle.net/1866/13031

Conception et évaluation d’un nouveau système de transfection ciblée, basé sur l’utilisation du système E/Kcoil

Thesis or Dissertation
Thumbnail
Louvier_Elodie_2015_these.pdf (27.31Mb)
2015-06 (degree granted: 2015-10-15)
Author(s)
Louvier, Elodie
Advisor(s)
Durocher, Yves
Level
Doctoral
Discipline
Biochimie
Keywords
  • Transfection ciblée
  • Transfection transitoire
  • Protéine recombinante
  • Système E/Kcoil
  • Vecteur non viral
  • High mobility group protein-1 (HMGB1)
  • Récepteur Cluster de différenciation 4 (CD4)
  • Sulfatation membranaire
  • Chlorate de sodium (NaClO3)
  • Targeted transfection
  • Transient transfection
  • Recombinant protein
  • E/Kcoil system
  • Non-viral vector
  • High mobility group protein-1 (HMGB1)
  • Cluster of differentiation 4 receptor (CD4)
  • Sulfated membrane
  • Sodium chlorate (NaClO3)
  • Biology - Cell / Biologie - Cellule (UMI : 0379)
Abstract(s)
Actuellement le polyéthylènimine (PEI) est l’agent de transfection transitoire le plus utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la production de protéines recombinantes à grande échelle par les cellules de mammifères. Il permet la condensation de l’ADN plasmidique (ADNp) en formant spontanément des nanoparticules positives appelées polyplexes, lui procurant la possibilité de s’attacher sur la membrane cellulaire afin d’être internalisé, ainsi qu’une protection face aux nucléases intracellulaires. Cependant, alors que les polyplexes s’attachent sur la quasi-totalité des cellules seulement 5 à 10 % de l’ADNp internalisé atteint leur noyau, ce qui indique que la majorité des polyplexes ne participent pas à l’expression du transgène. Ceci contraste avec l’efficacité des vecteurs viraux où une seule particule virale par cellule peut être suffisante. Les virus ont évolués afin d’exploiter les voies d’internalisation et de routage cellulaire pour exprimer efficacement leur matériel génétique. Nous avons donc supposé que l’exploitation des voies d’internalisation et de routage cellulaire d’un récepteur pourrait, de façon similaire à plusieurs virus, permettre d’optimiser le processus de transfection en réduisant les quantités d’ADNp et d’agent de transfection nécessaires. Une alternative au PEI pour transfecter les cellules de mammifèreest l’utilisation de protéines possédant un domaine de liaison à l’ADNp. Toutefois, leur utilisation reste marginale à cause de la grande quantité requise pour atteindre l’expression du transgène. Dans cette étude, nous avons utilisé le système E/Kcoil afin de cibler un récepteur membranaire dans le but de délivrer l’ADNp dans des cellules de mammifères. Le Ecoil et le Kcoil sont des heptapeptides répétés qui peuvent interagir ensemble avec une grande affinité et spécificité afin de former des structures coiled-coil. Nous avons fusionné le Ecoil avec des protéines capables d’interagir avec l’ADNp et le Kcoil avec un récepteur membranaire que nous avons surexprimé dans les cellules HEK293 de manière stable. Nous avons découvert que la réduction de la sulfatation de la surface cellulaire permettait l’attachement ciblé sur les cellules par l’intermédiaire du système E/Kcoil. Nous démontrons dans cette étude comment utiliser le système E/Kcoil et une protéine interagissant avec l’ADNp pour délivrer un transgène de manière ciblée. Cette nouvelle méthode de transfection permet de réduire les quantités de protéines nécessaires pour l’expression du transgène.
 
Pharmaceutical industry often employs polyethylenimine (PEI) for large scale protein production processes by transient transfection of mammalian cells. PEI condenses plasmid DNA (pDNA) by spontaneously forming positive nanoparticles known as polyplexes. Condensed pDNA is favoured for cell surface binding, internalization and protection from intracellular nucleases. While most of the cells efficiently uptake polyplexes, only 5 to 10% of captured pDNA reaches the nucleus for transgene expression. This suggests that polyplexes are hampered in their ability to route and to translocate to the nucleus necessitating large amounts of polyplexes to achieve high expression levels. By contrast, many viruses can efficiently transduce cells with only one or a few viral genome copies. Viruses have evolved to exploit cellular internalization and routing properties to express their own genetic material. We hypothesized that less pDNA would be used in an optimized transfection process if we exploited the internalization and routing properties that viruses use. DNA binding proteins could be used as an alternative to PEI to transfect mammalian cells. However, their usage is marginal due to the large protein quantities required to bind pDNA for transgene expression. If less pDNA is used less binding protein is needed. In this study, we used the E/Kcoil system to target a membrane receptor to deliver pDNA in mammalian cells. The Ecoil and Kcoil are two repeated heptapeptides which interact with a high affinity and specificity to form coiled-coil structures. We fused the Ecoil with a recombinant pDNA-binding protein. The Kcoil was fused to a stably-expressed membrane receptor in HEK293 cells. We discovered that low sulfation of the cell surface reduced non-specific binding of the pDNA:protein complex and permitted targeted binding via the E/Kcoil interaction. We demonstrate how to use recombinant pDNA-binding protein and the E/Kcoil system for targeted transgene delivery. This newly developed system provides a new transfection method, with reduced pDNA-binding protein quantities needed to achieve transgene expression.
Collections
  • Thèses et mémoires électroniques de l’Université de Montréal [17173]
  • Faculté de médecine – Thèses et mémoires [4044]

DSpace software [version 5.8 XMLUI], copyright © 2002-2015  DuraSpace
Contact Us | Send Feedback
Certificat SSL / SSL Certificate
les bibliothéques/UdeM
  • Emergency
  • Private life
  • Careers
  • My email
  • StudiUM
  • iTunes U
  • Contact us
  • Facebook
  • YouTube
  • Twitter
  • University RSS
 

 


DSpace software [version 5.8 XMLUI], copyright © 2002-2015  DuraSpace
Contact Us | Send Feedback
Certificat SSL / SSL Certificate
les bibliothéques/UdeM
  • Emergency
  • Private life
  • Careers
  • My email
  • StudiUM
  • iTunes U
  • Contact us
  • Facebook
  • YouTube
  • Twitter
  • University RSS