Étude structurale et fonctionnelle du canal potassium dépendant du voltage KvAP

Abstract

Les canaux ioniques dépendants du voltage sont responsables de l'initiation et de la propagation des potentiels d'action dans les cellules excitables. De nombreuses maladies héréditaires (channelopathies) sont associées à un contrôle défectueux du voltage par ces canaux (arythmies, épilepsie, etc.). L’établissement de la relation structure-fonction exacte de ces canaux est donc crucial pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques spécifiques. Dans ce contexte, le canal procaryote dépendant du voltage et sélectif au potassium KvAP a servi de modèle d’étude afin d’approfondir i) le processus du couplage électromécanique, ii) l’influence des lipides sur l’activité voltage-dépendante et iii) l’inactivation de type closed-state. Afin de pallier à l’absence de données structurales dynamiques du côté cytosolique ainsi que de structure cristalline dans l’état fermé, nous avons mesuré le mouvement du linker S4-S5 durant le gating par spectroscopie de fluorescence (LRET). Pour ce faire, nous avons utilisé une technique novatrice du contrôle de l’état conformationnel du canal en utilisant les lipides (phospholipides et non phospholipides) au lieu du voltage. Un modèle dans l’état fermé a ainsi été produit et a démontré qu’un mouvement latéral modeste de 4 Å du linker S4-S5 est suffisant pour mener à la fermeture du pore de conduction. Les interactions lipides - canaux jouent un rôle déterminant dans la régulation de la fonction des canaux ioniques mais ne sont pas encore bien caractérisées. Nous avons donc également étudié l’influence de différents lipides sur l’activation voltage - dépendante de KvAP et mis en évidence deux sites distincts d’interactions menant à des effets différents : au niveau du senseur de voltage, menant au déplacement de la courbe conductance-voltage, et du côté intracellulaire, influençant le degré de la pente de cette même courbe. Nous avons également démontré que l’échange de lipides autour de KvAP est extrêmement limité et affiche une dépendance à l’état conformationnel du canal, ne se produisant que dans l’état ouvert. KvAP possède une inactivation lente particulière, accessible depuis l'état ouvert. Nous avons étudié les effets de la composition lipidique et de la température sur l'entrée dans l'état inactivé et le temps de récupération. Nous avons également utilisé la spectroscopie de fluorescence (quenching) en voltage imposé afin d'élucider les bases moléculaires de l’inactivation de type closed-state. Nous avons identifié une position à la base de l’hélice S4 qui semble impliquée à la fois dans le mécanisme responsable de ce type d'inactivation et dans la récupération particulièrement lente qui est typique du canal KvAP.

Voltage-gated ion channels are responsible for the initiation and propagation of action potentials in excitable cells. Several hereditary diseases (channelopathies) are associated with a defective voltage control by these channels, leading to arrhythmias, epilepsy, etc. Hence, establishing the exact structure/function relation for ion channels is crucial for the development of new specific therapeutic agents. Here, the bacterial voltage-gated potassium channel KvAP served as a model to study i) electromechanical coupling, ii) influence of lipids on the voltage dependent activity and iii) closed-state inactivation. To overcome the lack of structural information on the cytosolic side and of crystal structure in the closed state, we determined the S4-S5 linker movement during gating using fluorescence spectroscopy (LRET). We were able to control the conformational state of the channels by using lipids (phospholipids and non phospholipids) instead of voltage clamp. Based on these experimental constraints, a model in the closed state was produced, showing that a small 4Å radial displacement of the S4-S5 linker is sufficient to close the conduction pore. Interactions between lipids and membrane proteins play an important role in the regulation of ion channels activity but are not well characterized. We studied the influence of different lipids on KvAP voltage-dependent activation and showed two distinct effects related to different interactions sites: one bound to the voltage sensor, leading to a shift of the conductance-voltage curve, and another at the intracellular side near the pore region, affecting the steepness of this curve. We also showed that the exchange of lipids is very limited around KvAP and seems to be state dependent, occuring only when the channels are kept in the open state. KvAP has a slow inactivation atypical, accessible from the open state. We studied the effects of lipid composition and temperature on entry into inactivation and recovery. We also used voltage-clamp fluorometry in bilayers to investigate closed-state inactivation molecular basis. We identified a position at the bottom of the S4 helix that seems involved in the mechanism for slow inactivation and the extremely slow recovery from inactivation typically displayed by KvAP.