Identification de déterminants impliqués dans la différenciation des cellules souches embryonnaires

Abstract

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC.

Stem cells have captured public’s attention in the last years, thanks to their involvement in cancer therapies and also their huge theoretical potential in the regenerative medicine field. In order to translate this new technology to the clinic, a better understanding of their regulatory mechanisms is still needed. It is well established that mouse embryonic stem cell (ESC) fate is highly regulated by core pluripotency factors. However, it is conceivable that novel self-renewal or differentiation regulators are not yet described. To investigate this possibility, we used a viral-based approach to generate a collection of ESC with nested chromosomal deletions called DelES (Deletion in ES cells). This library contains more than a thousand independent ESC clones highly enriched in chromosomal deletions which together cover ~25% of the mouse genome. Using this resource, we conducted an embryoid body (EB) differentiation screen and showed that several clones were having an abnormal EB formation phenotype. Complementation studies later identified Rps14-a ribosomal protein (RP) coding gene- as a novel haploinsufficient gene in EB formation from undifferentiated ESC. Further analyses of our screen results showed a strong bias for a subset of small subunit ribosomal protein genes which are critical for ESC differentiation but not for their self-renewal activity. Interestingly, the most severe differentiation phenotypes were found with ribosomal proteins associated to the ribosome’s mRNA exit site, namely Rps5, Rps14 and Rps28. While RP gene imbalance often leads to a p53 response that can be corrected by p53 suppression, ESC clones with decreased expression of mRNA exit site RP genes were surprisingly insensitive to p53 reduction, but were rescued by BAC or cDNA complementation, thus confirming the causative nature of these genes in the ESC phenotype. Finally, polysomal profiling and RNA-Seq studies showed that Rps5 deleted ESC exhibit an abnormal mesodermal gene signature. Together, our work presents a highly valuable resource for functional genomic studies in ESC and also highlights a novel p53-independent role linked to RP gene imbalance. Our results shed light on the relevance of these subunits for the developmental transition of ESC from a pluripotent to a differentiated state.