Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase prevents lipid peroxidation in cartilage from patients with osteoarthritis

Abstract

INTRODUCTION: Emerging evidence indicates that nitric oxide (NO), which is increased in osteoarthritic (OA) cartilage, plays a role in 4-hydroxynonenal (HNE) generation through peroxynitrite formation. HNE is considered as the most reactive product of lipid peroxidation (LPO). We have previously reported that HNE levels in synovial fluids are more elevated in knees of OA patients compared to healthy individuals. We also demonstrated that HNE induces a panoply of inflammatory and catabolic mediators known for their implication in OA cartilage degradation. The aim of the present study was to investigate the ability of inducible NO synthase (iNOS) inhibitor, L-NIL (L-N6-(L-Iminoethyl)Lysine), to prevent HNE generation through NO inhibition in human OA chondrocytes. METHOD: Cells and cartilage explants were treated with or without either an NO generator (SIN or interleukin 1beta (IL-1β)) or HNE in absence or presence of L-NIL. Protein expression of both iNOS and free-radical-generating NOX subunit p47 (phox) were investigated by western blot. iNOS mRNA detection was measured by real-time RT-PCR. HNE production was analysed by ELISA, Western blot and immunohistochemistry. S-nitrosylated proteins were evaluated by Western Blot. Prostaglandin E2 (PGE2) and metalloproteinase 13 (MMP-13) levels as well as glutathione S-transferase (GST) activity were each assessed with commercial kits. NO release was determined using improved Griess method. Reactive oxygen species (ROS) generation was revealed using fluorescent microscopy with the use of commercial kits. RESULTS: L-NIL prevented IL-1β-induced NO release, iNOS expression at protein and mRNA levels, S-nitrosylated proteins and HNE in a dose dependent manner after 24h of incubation. Interestingly, we revealed that L-NIL abolished IL-1β-induced NOX component p47phox as well as ROS release. The HNE-induced PGE2 release and both cyclooxygenase-2 (COX-2) and MMP-13 expression were significantly reduced by L-NIL addition. Furthermore, L-NIL blocked the IL-1β induced inactivation of GST, an HNE-metabolizing enzyme. Also, L-NIL prevented HNE induced cell death at cytotoxic levels. CONCLUSION: Altogether, our findings support a beneficial effect of L-NIL in OA by preventing LPO process in NO-dependent and/or independent mechanisms.

INTRODUCTION: De nouvelles données indiquent que l’oxyde nitrique (NO), que l’on retrouve en quantité accrue au niveau du cartilage de patients atteints d’ostéoarthrose (OA), joue un rôle dans la production de 4-hydrynonénal (HNE) via la formation de péroxynitrite (ONOO-). Le HNE est considéré comme étant un des produits les plus réactifs de la péroxidation lipidique (LPO). Notre laboratoire a rapporté des niveaux de HNE plus élevés que normal dans le liquide synovial provenant de genoux de patients OA comparativement aux sujets normaux. Nous avions aussi démontré que le HNE peut induire la production des médiateurs inflammatoires et cataboliques connus pour leurs implications dans la dégradation du cartilage dans l’OA. Le but de la présente étude est de vérifier si un inhibiteur sélectif pour la NO synthétase inductible (iNOS), soit le L-NIL (L-N6-(L-Iminoethyl)Lysine), peut empêcher la formation du HNE via l’inhibition de la production du NO dans des chondrocytes de patients OA. MÉTHODES: Les cellules ont été traitées soit avec ou sans un générateur du NO (SIN ou interleukine-1beta (IL-1β)) soit avec ou sans du HNE pendant 48 h en présence ou en absence du L-NIL. L’expression protéique de l’iNOS et de la sous-unité de la NADPH oxydase (NOX), la p47 (phox), a été vérifiée par Western blot. La génération du HNE a été révélée par ELISA, Western blot et immunohistochimie. Les niveaux de prostaglandine E2 (PGE2), gluthation-s-transférase (GST) et de la MMP-13 ont été mesurés par des kits commerciaux. La quantité de NO a été évaluée par la méthode de la réaction de Griess. La mesure des niveaux d'espèces réactives d’oxygène (ROS) a été effectuée par fluorescence en utilisant un kit commercial. RÉSULTATS: Le L-NIL inhibe la stimulation de la production de NO, de HNE ainsi que l’expression d’iNOS au niveau protéique et de l’ARNm par IL-1β. Le L-NIL bloque aussi la production de HNE indépendamment de la production de NO. La production des ROS et l’activation de p47 (phox) ont été inhibées par L-NIL. Fait intéressant, le L-NIL empêche la production de la PGE2, de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et de la MMP-13 induite par le HNE. CONCLUSION: les résultats obtenus semblent démontrer l’effet bénéfique du L-NIL dans l’OA via la prévention de la production du HNE de manière dépendante ou indépendant du NO.