Interpretation of the centromere epigenetic mark to maintain genome stability

Abstract

Le centromère est la région chromosomique où le kinétochore s'assemble en mitose. Contrairement à certaines caractéristiques géniques, la séquence centromérique n'est ni conservée entre les espèces ni suffisante à la fonction centromérique. Il est donc bien accepté dans la littérature que le centromère est régulé épigénétiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18α et Mis18β sont des protéines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères. Des évidences expérimentales démontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison à l'ADN nommé Myb, est la protéine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromères en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromères n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus.

De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont été identifiés par des expériences d'immunoprécipitation suivies d'une analyse en spectrométrie de masse. Un rôle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères a été attribué à MgcRacGAP, une des 60 protéines identifiées par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protéines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont été démontrées comme étant requises pour la stabilité de CENP-A incorporé aux centromères. Ces différentes observations ont mené à l'identification d'une troisième étape au niveau moléculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé en phase G1, celle de la stabilité de CENP-A nouvellement incorporé aux centromères. Cette étape est importante pour le maintien de l'identité centromérique à chaque division cellulaire.

Pour caractériser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères, une technique de microscopie à haute résolution couplée à une quantification d'image a été utilisée. Les résultats générés démontrent que le recrutement de KNL-2 au centromère est rapide, environ 5 minutes après la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nématode C. elegans a été résolue par RMN et celle-ci démontre un motif hélice-tour-hélice, une structure connue pour les domaines de liaison à l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune séquence n'est reconnue spécifiquement par ces domaines. Cependant, il a été possible de démontrer que ces deux domaines lient préférentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement à la chromatine H2B-GFP par un essai modifié de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnaître de façon spécifique la chromatine centromérique.

Finalement, l'élément reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement été identifié. En effet, il a été démontré que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprimés dans les cellules HeLa, mais plutôt avec les corps nucléaires PML, des structures nucléaires composées d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromériques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spécifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé uniquement aux régions centromériques.

Centromeres are chromosomal loci that direct kinetochore assembly in mitosis. Unlike genetic features, centromere DNA sequence is not conserved through phylogeny nor is it sufficient for centromere function. Therefore, it is commonly accepted that centromeres are epigenetically defined; a process mediated by the histone H3 variant CENP-A. KNL-2, also called M18BP1, together with its partners Mis18α and Mis18β is essential for newly synthesized CENP-A incorporation at centromeres in C. elegans and in humans. Evidence from the literature suggests KNL-2, having a predicted Myb DNA binding domain, as the most upstream player for CENP-A loading in G1. However, its actual function for CENP-A incorporation at the centromere and its binding partners required for the incorporation of CENP-A remained elusive.

New binding partners of KNL-2 were identified by immunoprecipitation experiments followed by mass spectrometry analysis. MgcRacGAP is one of the 60 hits identified and its role in the newly synthesized CENP-A incorporation pathway, together with the GEF ECT-2 and the small GTPase Cdc42, was confirmed by shRNA depletion. More interestingly, those proteins are required for the stability and the maintenance of incorporated CENP-A at centromeres. These observations lead to the identification of a third step in the CENP-A incorporation pathway important for the centromere identity maintenance over subsequent cell divisions.

To characterize the function of KNL-2 in the newly synthesized CENP-A incorporation pathway, high-resolution microscopy coupled to image quantification shows a rapid recruitment of KNL-2 at the centromere in early G1. Also, the predicted C. elegans KNL-2 Myb (CeMyb) domain structure was solved by NMR. This revealed an expected helix-loop-helix structure; which is the same for human KNL-2 Myb (HsMyb) domain. Those Myb domains bind DNA in vitro, however they do not bind any specific DNA sequence. Surprisingly, specific binding of the Myb domains to human CENP-A-YFP chromatin, compared to H2B-GFP, is observed by using a modified version of SIMPull assay under the TIRF microscope. Therefore, the KNL-2 Myb domain is sufficient to recognize and bind a specific feature generated by the presence of CENP-A nucleosomes at centromeres.

Finally, a centromeric chromatin feature recognized by the Myb domains under the TIRF microscope is proposed. HsMyb and CeMyb domains bind ssDNA, a RNA like structure, in vitro. Moreover, HsMyb and CeMyb domains do not co-localize with CENP-A in HeLa cells, whether with PML body staining, which are nuclear bodies known to contain RNAs. Thereby, by recognizing and binding centromeric transcripts, KNL-2 Myb domains might specify the newly synthesized CENP-A incorporation only at centromere loci.