Criblage génétique et caractérisation fonctionnelle des mutations dans les différentes sous-unités du récepteur GABAA associées à l'épilepsie génétique généralisée

Abstract

Les épilepsies génétiques généralisées (ÉGGs) sont un groupe de syndromes épileptiques hétérogènes qui se manifestent habituellement durant les périodes de l’enfance et de l’adolescence. Les ÉGGs représentent 30% de toutes les épilepsies. Il n’existe présentement aucun remède à l’épilepsie génétique généralisée. Au sein de ce groupe d’épilepsies, les sujets sont le plus souvent dépourvus de lésions cérébrales, ce qui signifie que les facteurs génétiques jouent un rôle important dans l’étiologie de la maladie. Au cours des dernières années, plusieurs gènes impliqués dans des formes familiales d’ÉGG ont été identifiés. La majorité d'entre elles codent pour des canaux ioniques incluant le récepteur-ligand GABAA (RGABAA). De ce groupe, des mutations ont été identifiées dans quatre sous-unités du récepteur GABAA. Dans un premier temps, l’objectif général de cette thèse vise l’évaluation de la composante génétique de notre cohorte d’ÉGG expliquée par les gènes codant pour les sous-unités du récepteur GABAA. Puis, dans un second souffle, le rôle des variants identifiés est défini et analysé afin de mieux cerner leurs impacts dans la pathogénèse de ce phénotype. La première partie du projet consiste en une analyse exhaustive des mutations existantes dans la partie codante des 19 gènes GABRA pour des patients atteints d’ÉGG. En criblant des familles québécoises avec ÉGG, nous avons identifié 22 variants rares incluant 19 faux-sens et 3 non-sens dans 14 sous-unités du RGABAA. En séquençant ces gènes dans une grande cohorte de cas et de contrôles, nous avons établi le profil des variations rares pour ceux-ci. Ces données suggèrent qu’une proportion significative (8%) des patients atteints d’ÉGG ont des variants rares sur les gènes du RGABAA. La deuxième partie porte directement sur certains gènes identifiés lors de la première partie. De ce groupe, cinq nouvelles mutations ont été découvertes dans des gènes déjà associés à l’épilepsie (GABRA1 et GABRG2). Nous avons constaté l’impact de ces mutations dans les mécanismes génétiques de l’épilepsie, en mesurant les effets des variants sur la structure et la fonction du récepteur GABAA. La troisième partie se concentre sur notre hypothèse, voulant que les RGABAA mutants altèrent l’effet du GABA durant le développement du système nerveux central (SNC). L’objectif principal vise à déterminer la contribution relative de chacune des sous-unités mutées dans le développement du SNC. Ainsi, nous avons démontré qu’une telle perte de fonction a un impact significatif sur le développement des synapses GABAergiques et glutamatergiques ainsi que sur la plasticité des circuits corticaux. Nos résultats nous ont permis de préciser comment les mutations dans les gènes GABRA peuvent mener à l’ÉGG. Éventuellement, la caractérisation moléculaire de ces mutations contribuera à l’élaboration de nouveaux outils diagnostiques et facilitera la mise au point de traitements mieux ciblés pour les gens atteints de cette condition neurologique chronique.

Genetic generalized epilepsy (GGE) syndrome is a group of epilepsy disorders that occur early in childhood and adolescence. Genetics generalized epilepsies (GGE) account for approximately 30 % of all epilepsy syndromes. There is currently no cure for GGE. Although patients with GGE typically have no anatomical brain abnormalities, the root cause of these conditions is considered to be genetic in origin. An increasing number of genes predisposing to epilepsy have been identified over the past ten years. It has emerged in many cases that the causative genes for inherited epilepsies code for ion-channels such as the GABAA receptor (GABAAR). Among these genes, mutations in four subunits of the GABAA receptor appear to be an important cause of familial epilepsy. The main aim of the present thesis is to better characterize the genetic component of our GGE cohort explain by GABRA genes and evaluated the critical role of these variants in the pathogenesis of this phenotype. The first part of our project was to investigate the impact of rare variants of GABAAR in GGE, we screened the coding regions of 19 genes encoding for all the known subunits of the GABAAR in unrelated GGE patients, including familial cases. Overall, approximately 8% of our GGE individuals have novel GABRA mutations, including 19 missenses and 3 nonsenses including 1 frameshift mutation. By sequencing those genes in a large cohort of cases and controls, we were able to establish the profile of rare variants for these genes. Our data suggest that a significant proportion of GGE patients share rare variants in GABRA genes. The second part of the work builds on the genes bearing mutations identified in the sequencing analysis. Among this group, five novel mutations have been so far associated to this syndrome (GABRA1 and GABRG2). We characterized the gating properties of GABA-evoked currents and the subcellular localization of the mutated subunits by expressing recombinant GABAA receptors in vitro. The third part of the work aimed to characterize the impact of mutated GABAA receptors on synapse formation and development of neuronal networks. By knocking down these genes in cortical organotypic slices, we provided a better understanding of the specific and distinct neural circuit alterations caused by different GABRA1 mutations and help define the pathophysiology of genetic generalized epilepsy syndromes.

We believe that these findings will allow a better understanding of the genetic mechanisms underlying the disease and involve mutations in GABAA receptors in critical mechanisms leading to epilepsy. Eventually, our results could lead to a better diagnosis and counteract the devastating effects of some GGEs early on before this complex condition has had the opportunity to be established.