Pro-inflammatory and angiogenic activities of VEGF and angiopoietins in murine sponge/Matrigel model

Abstract

La dérégulation de la formation et l'intégrité des vaisseaux sanguins peut conduire à un état pathologique tel qu’observé dans de nombreuses maladies ischémiques telles que: la croissance de tumeur solide, l’arthrite rhumatoïde, le psoriasis, les rétinopathies et l'athérosclérose. Par conséquent, la possibilité de moduler l'angiogenèse régionale chez les patients souffrant d'ischémie est cliniquement pertinente. Un élément clé dans l'induction de l'angiogenèse pathologique est une inflammation qui précède et accompagne la formation des nouveaux vaisseaux. Ce phénomène est démontré par l'augmentation de la perméabilité vasculaire et le recrutement de monocytes/ macrophages et cellules polynucléaires (neutrophiles). En collaboration avec d'autres groupes, nous avons montré que différents facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et les angiopoïétines peuvent non seulement promouvoir l'angiogenèse mais aussi induire diverses étapes connexes au processus de la réaction inflammatoire, y compris la synthèse et la libération des médiateurs inflammatoires et la migration des neutrophiles. Les objectifs de notre étude étaient d'adresser si le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) sont capables de promouvoir la formation des nouveaux vaisseaux sanguins au fil du temps et d'identifier la présence de différentes cellules inflammatoires dans ce processus. Des éponges d'alcool polyvinylique stérilisées et imbibées de Matrigel appauvri en facteur de croissance (contenant PBS, VEGF, Ang1 ou Ang2 (200 ng/200 μl)) ont été insérées sous la peau de souris C57/Bl6 anesthésiées. Les éponges ont ensuite été retirées aux jours 4, 7, 14 ou 21 après la procédure pour des analyses histologiques, immunohistologiques et cytométriques. La formation des nouveaux vaisseaux a été validée par la coloration au Trichrome de Masson et des analyses histologiques et immunohistologiques contre les cellules endothéliales (anti-CD31). De plus, la maturation des vaisseaux a été démontrée par la coloration séquentielle contre les cellules endothéliales (anti-CD31) et musculaires lisses (anti-alpha-actine). Nous avons effectué la même procédure pour caractériser le recrutement de neutrophiles (anti-MPO), et de macrophages (anti-F4/80). Afin de mieux délimiter la présence de différents sous-ensembles de leucocytes recrutés dans les éponges, nous avons utilisé une technique de cytométrie en flux sur des préparations de cellules isolées à partir de ces éponges. Nous avons observé que le VEGF et les angiopoïétines favorisent le recrutement de cellules endothéliales et la formation de nouveaux vaisseaux plus rapidement qu’en présence de PBS. Une fois formé au jour 7, ces nouveaux vaisseaux restent stables en nombre, et ne subissent pas une réorganisation importante de leur surface. Ces vaisseaux maturent grâce au recrutement et au recouvrement par les cellules musculaires lisses des néovaisseaux. En outre, le microenvironnement angiogénique est composé de cellules inflammatoires, principalement de neutrophiles, macrophages et quelques cellules de type B et T. Donc, le VEGF, l’Ang1 et l’Ang2 induisent séparément la formation et la stabilisation de nouveaux vaisseaux sanguins, ainsi que le recrutement de cellules inflammatoires avec des puissances différentes et une action temps-dépendante dans un modèle d’éponge/Matrigel.

A deregulation in blood vessel formation and integrity can lead to a pathological state as seen in many ischemic diseases such as tumor growth, rheumatoid arthritis, psoriasis, retinopathies and atherosclerosis. Therefore, the possibility to modulate regional angiogenesis in patients suffering from ischemia is clinically relevant. One key feature in the induction of pathological angiogenesis is that inflammation precedes and accompanies the formation of neovessels as evidenced by increased vascular permeability and the recruitment of monocytes/macrophages and neutrophils. Along with other groups, we have previously shown that selected growth factors, namely vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietins (Ang1 and Ang2) can not only promote angiogenesis but can also induce inflammatory responses, including the synthesis/release of inflammatory mediators and neutrophil migration. The objectives of our study were to address how VEGF and angiopoietins are capable of promoting the formation of neovessels over time and to identify the presence of different inflammatory cells in this event. Sterilized polyvinyl alcohol (PVA) sponges soaked in growth factor-depleted Matrigel containing PBS, VEGF, Ang1 or Ang2 (200 ng/200 μl) were subcutaneously inserted into anesthetized C57/Bl6 mice. The sponges were then removed at day 4, 7, 14 or 21 post-procedure for histological, immunohistological (IHC) and flow cytometric analyses. The formation of neovessels was validated by Masson’s Trichrome staining and by IHC against endothelial cells (anti-CD31) and its maturation was elucidated by sequential IHC staining against endothelial cells and smooth muscle cells (anti-alpha-actin). Likewise, we performed IHC to characterize the recruitment of neutrophils (anti-MPO), and macrophages (anti-F4/80). To better delineate the presence of different leukocyte subsets recruited in the sponges, we utilized multicolor flow cytometry procedure on single cell preparation from the sponges. We observed that both VEGF and angiopoietins favors the recruitment of endothelial cells and the formation of new vessels more rapidly as compared to PBS. Once formed by day 7, these neovessels remain stable in number, do not undergo reorganization in their cross sectional area and mature through the recruitment and ensheathing of smooth muscle cells. In addition, the angiogenic microenvironment is comprised of inflammatory cells, mainly neutrophils, macrophages, and sparsly T and B cells. Hence, VEGF, Ang1 and Ang2 individually promote the formation and stabilisation of neovessels and the venue of inflammatory cells with different potency in a temporal dependant manner in a sponge/Matrigel model.