Étude structuro-fonctionnelle de SecP43 et caractérisation de ses interactions avec SepSecS et l’ARNtSec in vitro

Abstract

Selenoproteins are proteins containing selenium in the form of the 21st amino acid, selenocysteine. Selenocysteine (Sec) is directly synthesized onto its cognate tRNA (tRNA[Ser]Sec or tRNASec) and inserted into selenoproteins co-translationally with the help of various cis- and trans-acting factors. Among those factors, SecP43 has been reported to possibly play an essential role in the methylation at the 2’-hydroxylribosyl moiety in the wobble position (Um34) of Sec-tRNA[Ser]Sec and consequently reduce the expression of glutathione peroxidase 1. SecP43 also called tRNASec-associated protein has also been reported to interact in with SepSecS and tRNASec in vivo and the targeted removal of one of these proteins affected the binding of the other to the Sec-tRNASec. The initial aim of the project was to solve the structure of SecP43 by means of x-ray crystallography. Secondly, we were interested in characterizing the interaction of the latter with some of the components of the selenocysteine insertion machinery. These factors are SepSecS and tRNASec. We were able to optimize the expression and the purification of soluble form of the human homologue of SecP43 and of SepSecS by using an adapted auto-induction protocol. This was a major challenge considering that full length SecP43 has not been expressed and purify to date. We did not succeed in crystallizing SecP43. Our failure to crystallize SecP43 is probably due to the fact that it is a partially folded protein as we were able to demonstrate by SAXS (Small Angle X-ray Scattering). The SecP43 envelope calculated by SAXS displayed a rod-shape like structure. In order to enhance the stability of SecP43 required for crystallization, binding affinity studies were conducted to characterize the interaction between SecP43, tRNASec and SepSecS. We did not detect an interaction between SecP43 and tRNASec by using EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) and gel filtration. We also could not detect an interaction between SecP43 and SepSecS using a cross-linking assay. In contrast, the tRNASec/SepSecS interaction was demonstrated by EMSA and the addition of SecP43 seemed to reduce the binding affinity. Therefore, SecP43 might induce a conformational change in SepSecS in the presence of tRNASec.

Les sélénoprotéines sont des protéines contenant du sélénium sous la forme du 21ème acide aminé, la sélénocystéine. Sélénocystéine (Sec) est synthétisé sur son ARNt (ARNt[Ser]Sec ou ARNtSec) et inséré dans les sélénoprotéines de manière co-traductionnelle, avec l'aide de divers facteurs agissant en cis et en trans. Parmi ces facteurs, SecP43 joue possiblement un rôle dans la méthylation du groupement 2'- hydroxylribosyl dans la position d'oscillation (Um34) du Sec-ARNt[Ser]Sec et par conséquent, l’inhibition de SecP43 réduit l'expression de la glutathion peroxydase 1. L’interaction SecP43/ARNtSec/SepSecS a été démontrée in vivo et le retrait ciblé d’une de ces protéines affecte la liaison de l’autre à Sec-ARNtSec. L'objectif initial du projet était de résoudre la structure de SecP43 par cristallographie. En second lieu, nous avons voulu caractériser l’interaction de ce dernier avec certaines composantes de la machinerie d'insertion de la sélénocystéine. Ces facteurs sont notamment SepSecS et ARNtSec. Nous avons optimisé la surexpression et la purification des homologues humains de SecP43 et SepSecS en utilisant un protocole d'auto-induction. Ce fut un défi majeur étant donné que SecP43 n'avait pas encore été surexprimée et purifiée à ce jour. Nous n'avons pas réussi à cristalliser SecP43. Cet échec s’explique probablement par le fait que SecP43 est une protéine dynamique et partiellement replié comme nous avons pu le démontrer par SAXS (Small Angle X-ray Scattering). L'enveloppe de SecP43 calculée par SAXS présente une structure filiforme et non globulaire. Afin d'améliorer la stabilité de SecP43 requise pour la cristallisation, des études d'affinité de liaison ont été conduites pour caractériser les interactions entre SecP43, ARNtSec et SepSecS. Aucune interaction substantielle n’a pu être démontrée entre SecP43 et ARNtSec par retard sur gel ou par chromatographie d’exclusion stérique. Le même constat fut fait pour l’interaction SecP43/SepSecS. En revanche, l’interaction ARNtSec/SepSecS a été démontrée par EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) et l'addition de SecP43 semble réduire l'affinité de liaison de ladite interaction. Par conséquent, SecP43 induirait un changement conformationel de SepSecS en présence du ARNtSec.